منبع علمی مقاله –252

1-2-3-2-د-گوشت مرغ
به علت سفت بودن بافت و عدم توانایی در جذب مواد مورد استفاده در مرغ برگرها از مرغ مادر استفاده نمی شود ولی در محصولاتی که مواد تردکننده استفاده میشود میتواند به کار رود، البته از نظر استاندارد استفاده از مرغ مادر به علت آلودگی ممنوع است (Farkas and Singh 1991; Hongsheng, Qingshu et al. 1997).
در تولید خمیر مرغ تقلباتی صورت میگیرد از قبیل:
1) در بعضی از کارخانجات مرغ منجمد را بهطور کامل در دستگاه بادر میاندازند چون همه به صورت خمیر درمیآیند مشخص نمیشود، این خمیر آلودگی بسیار بالایی دارد چون پوست، بال و رگههای گردن را نمی گیرند.
2) اندازه فیلترها را بزرگتر میکنند یا دو بار از بادر رد میکنند که باعث میشود در محصول ریز استخوانهایی باقی بماند که وقتی خورده میشود در دهان احساس میشود. اگر تولید خمیر مرغ از اسکلت به صورت اصولی تهیه شود از نظر تغذیهای مفید هم میباشد.
1-3-انواع تقلب در فرآورده های غذایی
با افزایش روز افزون جمعیت، تهیه غذای کافی یکی از مسایل پیچیده ومهم جهان امروز به شمارمی رود. هر ساله میلیون ها مورد بیماری در جهان بر اثر استفاده مواد غذایی ناسالم دیده می شود. مواد غذایی همواره دارای مشتری و کاربرد عمومی هستند. گاهی ممکن است افراد سودجو و متقلب به فکر استفاده از بازار پر فروش و پر رونق آن بیفتند و برای کم کردن هزینه های تولید و به دست آوردن سود بیشتر دست به تقلب در موادغذایی بزنند که از این راه سلامت مردم را به خطر می اندازند. بیشتر این تقلب ها در بازار خرده فروشی هاست؛ اما گاه ممکن است به بازار فروش مواد اولیه هم سرایت کند. بنابراین آشنایی با این تقلب ها و راه های تشخیص آن برای کنترل مواد غذایی بسیار مفید است (Regattieri, Gamberi et al. 2007; Spink and Moyer 2011).1-3-1-تقلب در فرآورده های گوشتی

 برای دانلود فایل کامل به سایت منبع مراجعه کنید  : elmname.com

یا برای دیدن قسمت های دیگر این موضوع در سایت ما کلمه کلیدی را وارد کنید :

 

تقلب در گوشت قرمز: گوشت و بیشتر فرآورده های آن گران قیمت هستند و امکان تقلب در آن ها زیاد است.
از جمله تقلب هایی که در فرآورده های گوشتی اتفاق می افتد عبارتند از:
افزودن مواد ازته غیرپروتئینی به نحوی که در آزمون های کنترل مقدار ازت بالا تر به نظر برسد
افزودن پودر استخوان به فرآورده های گوشتی مانند سوسیس و کالباس
افزودن پودر خون به همبرگر و سوسیس و کالباس
رعایت نکردن فرمول و استاندارد فرآورده های گوشتی و افزودن مقادیر زیاد مواد پر کننده
افزودن نیتریت و نیترات به مقدار بیش از حد برای بهبودی رنگ و جلوگیری از رشد میکروارگانیسم ها در موارد آلودگی شدید
فر آورده های گوشتی یکی از پر مصرف ترین فرآورده های غذایی به شمار آمده و تنها درکشور آلمان که یکی از بزرگترین تولید کننده های فرآورده های گوشتی می باشد بیش از پانصد نوع محصول گوشتی با اسامی مختلف وجود دارد. در سایر نقاط جهان نیز تعداد این محصولات بسیار فراوان می باشد و به 1200 نوع می رسد. با توجه به این که مصرف فرآورده های گوشتی به دلایل مقرون به صرفه بودن این فرآورده ها نسبت به قیمت خرید گوشت سفید یا قرمز، تسهیل در پخت و پز و مطلوب بودن طعم آن نسبت به غذای سنتی، روند رو به رشدی در جامعه پیداکرده است، برخی از تولیدکنندگان این فرآورده ها مبادرت به تولید محصولاتی نموده اند که در تولید آن بافت های نامطلوب و غیر مجاز نیز به کار برده اند. حضور این بافت های غیر مجاز در فرآورده های گوشتی یک مشکل حقیقی در شناسایی آن از بافت های مجاز آن فرآورده ایجاد می کند. با این وضعیت به کار گیری روشی دقیق برای شناسایی بافت های غیر مجاز در فرآورده های گوشتی حرارت دیده غیر قابل اجتناب می باشد تا سطح کیفیت این نوع فرآورده ها را بیشتر مورد توجه قرار دهد (Anklam and Battaglia 2001). هنگامی که روشی برای شناسایی بافت های غیر مجاز وجود داشته باشد می توان مجازاتی را نیز برای افراد خاطی که از بافت های غیر مجاز در تولید فرآورده های گوشتی حرارت دیده استفاده می کنند تعیین نمود.
1-4-کنترل کیفیت فرآورده های گوشتی
کنترل کیفیت مواد غذایی فرآیندی است که میزان تبعیت یک ماده غذایی بسته بندی شده از برچسب نگاشته شده بر روی خود را بررسی می نماید. آرتور هیل برای اولین روشی را جهت بررسی و کنترل کیفیت مواد غذایی در سال 1861 ارائه کرد که به صورت بررسی میکروسکوپی دارویی انجام شد (Hassall 1876).
تعریف جهانی که از واژه کنترل کیفی و یا اعتبار سنجی وجود دارد طبق قانون 2002/178 کمیسیون اروپا است، درواقع یک واژه تعریف شده است که توانایی شناسایی گونه های مختلف و فرآورده های حیوانی را طی مراحل مختلف در زنجیره غذایی (مراحل تولید تا توزیع) نمایان می کند. از طرفی دیگر مطابق قوانین کمیسیون اروپا به منظور ایمنی مواد غذایی، در تمام دنیا تولیدکنندگان ملزم به آشکارسازی و بیان نام تمام مواد اولیه خام مورد استفاده بر روی برچسب فرآورده های غذایی هستند.
امروزه اعتماد به برچسب های قرار گرفته شده بر روی فرآورده های غذایی و صحت و سقم آن به یکی از چالش های تولید کنندگان مواد غذایی در بازار کشاورزی و غذایی تبدیل گردیده است (Lenahan, Thomas et al. 1973; Nilsson, Tunçer et al. 2004). این نیاز سبب طراحی مطالعات متعددی در این زمینه شده است تا بتوانند اعتماد مصرف کنندگان به فرآورده های غذایی را به خود جلب کنند. تمامی این موارد با توجه به افزایش روزافزون نیاز مردم جان به فرآورده های غذایی آماده و نیمه آماده، افزایش علم عمومی که سبب شناخت آن ها نسبت به خطرات ناشی از مواد غذایی شده است و در نهایت افزایش توجهات به تأثیری که موجودات اصلاح ژنتیک شده می توانند بر زنجیره غذایی انسان و محیط اطراف گذارند، نشان دهنده اهمیت برنامه کنترل کیفیت و اعتبار سنجی ارائه شده می باشد.
میزان اعتبار برچسب های ارائه شده بر روی مواد غذایی یک مسأله مهم برای مصرف کنندگان و کارشناسان فرآورده های غذایی است زیرا عدم تطابق موارد ارائه شده بر روی برچسب قرار گرفته روی فرآورده های غذایی با منشأ حیوانی می تواند اثرات منفی قابل توجهی را از جنبه های مختلف به دنبال داشته باشد (Angulo, Gil et al. 2005). جنبه های مختلفی ذکر شده را می توان از سه جهت مورد نقد و بررسی قرار داد:
1) تقلب تجاری: با هدف سوء استفاده، تولید کنندگان فرآورده های غذایی می توانند با توجه به قیمت بالای برخی مواد غذایی، آن ها را با موادی که دارای هزینه پایین تری هستند جایگزین نمایند. همچنین می تواند علاوه بر قیمت سبب جایگزینی گونه ای با ارزش غذایی کمتر به جای گونه ای با ارزش غذایی بیشتر شود.
2) ممکن است افرادی به برخی از رژیم های غذایی آلرژی داشته باشند و استفاده از آن ها پیامدهای جبران ناپذیری را به همراه داشته باشد. ذکر موارد اشتباه بر روی فرآورده های غذایی می تواند به سلامت مصرف کننده آسیب برساند.
3) دیگر نکته مهم در بحث فرآورده های غذایی ممنوعیت استفاده از برخی گوشت ها در برخی از مذاهب می باشد. استفاده از این گوشت ها و عدم بیان آن ها در برچسب ارائه شده بر روی آن می تواند اثرات روحی روانی نامناسبی بر روی شخص مصرف کننده گذارد.
مطابق با استانداردهای Appendix، ترکیبات موجود در فرآورده غذایی باید بصورت زیر بر روی برچسب های قرار گرفته بر روی بسته بندی فرآورده درج گردند:
تمام مواد اولیه مطابق استانداردهای FDA باشند و نام تمام مواد اولیه مورد استفاده در فرآورده به طور مشخص بر روی برچسب بسته بندی درج شود.
ماده حاصل از هیدرولیز پروتئین باید با نام های مورد استفاده و رایج معرفی گردد و نام پروتئین هیدرولیز شده بر روی برچسب ذکر شود.
افزودنی های رنگی مجاز FDA نیازمند لیستی از نام های رایج می باشند و افزودنی های رنگی فاقد نام مجاز باید با نام "رنگ مصنوعی " و یا "رنگ افزوده " مشخص گردد.
محصولات گوشتی فرآوری شده مورد استفاده به عنوان ماده اولیه، بدون نیاز به ذکر میزان استفاده آن ها، نیازمند آشکارسازی کامل تمام مواد اولیه در فرمولاسیون فرآورده های گوشت و ماکیان است.
در فرآورده های حاوی مخلوط گوشت و مرغ، اگر یکی (از نظر کمّی) بسیار بیشتر از دیگری بود باید بر روی برچسب، نام آن ذکر شود و در صورت تساوی مقادیر، نام هر دو ذکر گردد.
در فرآورده های حاوی پروتئین گیاهی، گوشت تازه و مرغ، اگر میزان گوشت تازه یا مرغ از پروتئین گیاهی بسیاربیشتر بود (مثلاً نسبت 13:1) میزان پروتئین گیاهی فریبنده نیست و فقط نیاز است که بر روی برچسب مواد اولیه ذکر شود اما در صورتی که این نسبت کمتر از 13:1 اما بیشتر و یا مساوی 10:1 باشد، باید نام پروتئین گیاهی در کنار نام محصول ذکر شود مثلاً : هات داگ با گوشت گاو و پروتئین گیاهی بافت دارافزوده شده (Boylston, Chen et al. 2012).
1-5-تکنیک های مرتبط با کنترل کیفی عام
1-5-1-آزمایشات شیمیایی
در این آزمایشات آن ویژگی از ماده اولیه که در تهیه محصول اثر میگذارد فقط مورد آزمایش قرار می گیرد، برای مثال در آرد سوخاری میزان کربوهیدرات را اندازهگیری میکنند. روزانه به صورت تصادفی یک تا دو نمونه از قسمتهای مختلف سالن تولید برداشته و آزمایشات شیمیایی مورد نظر (مثل درصد چربی، روغن، خاکستر و ...) را انجام میدهند (Love and Pearson 1971).
1-5-1-1-جستجوی پلیفسفاتها در گوشت و فرآوردههای آن
جهت بررسی و اندازه گیری پلی فسفات ها در گوشت و فرآورده های غذایی از مراحل زیر استفاده می شود (Klose, Campbell et al. 1963):
تهیه لایه سلولزی
تهیه نمونه مورد آزمایش
تهیه سرم
جداسازی کروماتوگرافی
تعیین فسفاتها
1-5-2-آزمایشات میکروبی
دستگاههای آزمایشگاه میکروبی، آون، 3 تا انکوباتور با دماهای مختلف، هود باکتریولوژیکی، اتوکلاو، روش های سریع (rapid) (یکسری محیط کشتهایی است که تا 24 ساعت جواب میدهد و با تغییر رنگ بستگی به نوع تغییر رنگ مشخص میکند که سالمونلا، اشیرشیا و ... وجود دارند.) میباشد (Ellis, Broadhurst et al. 2002).
1-5-3-روش اندازه‏گیری رطوبت گوشت و فرآورده‏های آن
ظرف را که حاوی 4-3 برابر وزن نمونه مورد آزمون شن است همراه با میله بلوری به مدت نیم ساعت در اتوو 2 ± 103 درجه خشک کنید و بگذارید که ظرف و محتویات آن در دسیکاتور تا درجه حرارت آزمایشگاه سرد شود و سپس با دقت یک میلیگرم آن را توزین کنید. 10-5 گرم از نمونه آماده شده را به ظرف منتقل کرده و مجددا به دقت یک میلیگرم آن را توزین کنید.برحسب وزن نمونه 10-5 میلیلیتر الکل اتیلیک به ظرف اضافه کرده به وسیله میله طوری مخلوط کنید و آن را روی حمام آب که درجه حرارت آن برای جلوگیری از بیرون انداختن قسمت‏هایی از نمونه بین 80-60 درجه تنظیم شده حرارت دهید و گاهی بهم زنید تا الکل تبخیر شود. ظرف و محتویات آن را مدت 2 ساعت در اتوو که در 2 ± 103 درجه تنظیم شده حرارت دهید، سپس ظرف را از اتوو به دسیکاتور منتقل نمایید و آنگاه بگذارید ظرف تا درجه حرارت آزمایشگاه سرد شود و سپس به دقت یک میلی‏گرم آن را توزین کنید. عملیات بالا را تکرار کنید تا نتیجه دو توزین پشت سرهم که با یک ساعت حرارت دادن از هم فاصله داشته باشند بیش از 1/0% وزن نمونه اختلاف نداشته باشد.
1-5-4-تعیین pH گوشت و فرآوردههای آن
الکترود را داخل نمونه قرار می دهند و سیستم تصحیح دمای pH متر را با دمای نمونه تنظیم می نمایند. نمونه را با همزن بهم زده تا همگن شود و سپس با استفاده از pH متر، pH را اندازه شود. همچنین برای اندازه گیری PH در فرآورده های غیرهمگن، با یک کارد سوراخی در نمونه ایجاد نموده تا در موقع قرار گرفتن الکترود در آن موجب شکستگی نگردد. دمای نمونه را تنظیم نموده و سپس pH را با استفاده از pH متر اندازهگیری نمایید.
1-5-5-اندازه‏گیری پروتئین تام در گوشت و فرآورده‏های آن
در حدود 2 گرم از نمونه آماده شده را در کاغذ صافی کوچک و یا یک ورقه کوچک آلومینیومی که قبلاً توزین شده به دقت 1/0 میلی‏گرم توزین کرده و در داخل بالن هضم بیاندازید. سپس 20 میلی‏لیتر اسید سولفوریک غلیظ و 8 گرم از مخلوط کاتالیزور (96 درصد سولفات پتاسیم و 5/3 درصد سولفات مس و 5/0 درصد اکسید سلینوم) به آن افزوده و بالن را به دستگاه مخصوص هضم کلدال وصل کرده و حرارت دهید. حرارت باید در ابتدا ملایم بوده و پس از این‏که محتوی بالن دیگر کف نکرد حرارت را زیاد کنید و ‏گاهی بالن را به هم بزنید. حرارت را آن‏قدر ادامه دهید تا مواد آلی هضم شود و مایع تقریبا بی‏رنگی در ته بالن باقی بماند سپس حرارت را مدت 5/0 تا 1 ساعت ادامه دهید. هرگاه دیواره بالن آلوده به نمونه باشد بایستی پس از سردشدن بالن هضم آن را با مقدار کم آب مقطر شسته تا تمام نمونه در ته بالن جمع شود سپس مجددا آن را حرارت داده تا مواد آلی کاملا هضم شود. بالن را بگذارید سرد شود و سپس آن را با 400 میلی‏لیتر آب مقطر در دفعات مکرر شستشو داده و از راه قیف مربوط به بالن تقطیر به داخل آن بریزید. عمل شستشوی بالن هضم را چندین مرتبه تکرار کنید تا مطمئن شوید تمام قسمت هضم شده به بالن دستگاه تقطیر وارد شده و چیزی از آن هدر نرفته باشد سپس چند قطعه سنگ جوش به آن بیفزایید. در زیر مبرد دستگاه تقطیر یک ارلنمایر محتوی 500 میلی‏لیتری محتوی 50 میلی‏لیتر محلول اسیدبوریک و چند قطره متیل قرمز قرار دهید. دستگاه تقطیر را با دقت نصب کنید و توجه داشته باشید که شیر آب مربوط به مبرد باز باشد و قسمت‏های مختلف دستگاه به طور محکم به هم مربوط باشند. سپس از راه قیف به مقدار کافی محلول سود 50% بیفزایید تا محیط قلیایی شود (حداقل 75 میلی‏لیتر سود لازم است) بالن را حرارت دهید و عمل تقطیر را در حالی‏که انتهای مبرد در محلول اسید بوریک قرار دارد ادامه داده تا تمام آمونیاک موجود در ظرف گیرنده جمع شود.
در حدود 200 تا میلی‏لیتر از محلول تقطیر شده را جمع‏آوری نموده ابتدا شیر قیف را باز کرده و سپس حرارت را قطع کنید و انتهای مبرد را از داخل محلول اسید بوریک خارج کرده و پس از چند دقیقه تقطیر آزاد حرارت را قطع کنید و قسمت خارجی مبرد را با کمی آب مقطر به داخل ارلنمایر بشویید و محلول را به وسیله اسید سولفوریک 1/0 نرمال تیتر کنید. همین آزمایش را برای محلول شاهد انجام دهید.
1-6-تکنیک های کاربردی در شناسایی گونه های گوشتی
علاوه بر تکنیک های کلی ذکر شده جهت کنترل کیفی عام فرآورده های غذایی، تکنیک های متعددی وجود دارند که می توان از آن ها برای شناسایی گونه های استفاده شده در تهیه فرآورده های گوشتی استفاده نمود. مهمترین تکنیک هایی که در حال حاضر برای شناسایی گونه های گوشتی می توان از آنها استفاده نمود در شکل 1-1 و مهمترین تکنیک های کاربردی برای شناسایی پروتئین گیاهی سویا در شکل1-2 خلاصه شده است.

شکل 1-1-تکنیک های موجود برای شناسایی گونه های گوشتی

شکل 1-2-تکنیک های موجود برای شناسایی پروتئین گیاهی سویا
1-6-1- تکنیک های مبتنی بر پروتئین
مرحله اولیه برای بررسی پروتئین ها جداسازی پروتئین ها از نمونه ها است. از مهمترین و معتبرترین روش های جداسازی پروتئین ها می توان به الکتروفورز و کروماتوگرافی اشاره نمود. الکتروفورز اولین بار توسط شیمیدان سوئدی آرن تیسلیوس ابداع شد. در سال 1937، تیسلیوس روشی برای جداسازی الکتروفورتیک پروتئین های سرم ابداع کرد. انگیزه اصلی برای طراحی این روش، که بعدها به الکتروفورز منطقه ای مشهور شد، مشکلاتی بود که در حین بررسی پروتئین های سرم وجود داشت. تیسلیوس برای اولین بار فراکنش های آلفا، بتا، و گاما را در سرم تشریح و نام گذاری کرد. وی به خاطر تحقیق بر روی الکتروفورز و آنالیز جذبی، بخصوص اکتشافاتی که ماهیت پیچیده پروتئین های سرم را مشخص می کرد، جایزه نوبل شیمی را در سال 1948 از آن خود کرد (Altria 1999). از دیگر روش های قدیمی کروماتوگرافی است که خود دارای انواع مختلفی است که اولین نوع آن را می توان کروماتوگرافی ژلی در نظر گرفت. این نوع کروماتوگرافی برای اولین بار در سال 1954 معرفی و در سال 1959 اصلاح شد. در این روش، جداسازی‌هایی مبتنی بر الک کردن مولکولی بر روی اجسام بی‌بار در جریان مهاجرت الکترو اسمزی از داخل ژل‌ها انجام می‌شود. بدین ترتیب که جداسازی بر مبنای اندازه‌های نسبی مولکول ها انجام شده و از اصطلاح صاف کردن به وسیله ژل استفاده می‌شود. ژل استفاده شده در این روش باید بی اثر و پایدار باشد. در ادامه پس از دهه 80 میلادی با توجه به نیاز به ابداع روش های جدید تجزیه تحلیل پروتئین ها با دقت بسیار بالا بر اساس ساختار و عملکرد پروتئین و واکنش بین پروتئین ها جهت جداسازی، ‏شناسایی و تشخیص پروتئین های روش های فوق الذکر ارتقاء پیدا کردند که شامل تکنیک های کاربردی نظیر جدایی پروتئین محلول در آب به وسیله نشاسته، ‏پلی آکریل آمید یا الکتروفورز ژل آگارز‎ ‎، الکتروفورز دو بعدی، کروماتوگرافی مایع و کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا بود (Abramson, Moyer et al. 1942; Lopez 2007).
به طور کلی، در اغلب روش ‏های الکتروفروتیک مربوط به شناسایی گونه ها در گوشت خام، از پروتئین های سارکوپلاسمی استفاده می شود که این موضوع به ‏دلیل دمای بالاتر دناتوراسیون و حلالیت بیشتر پروتئین های سارکوپلاسمی نسبت به سایر پروتئین ها می باشد. از جمله روش های دیگر مبتنی بر پروتئین ها که هیچ ارتباطی به استخراج پروتئین ها ندارد، استفاده از مطالعات بافت شناسی می باشد که در آن پس از تهیه لام های بافتی، توسط آنتی بادی های منوکلونال اختصاصی یک پروتئین خاص هدف گیری شده و توسط میکروسکوپ فلورسانس مورد مطالعه و بررسی قرار می گیرد. این روش نیز کاربرد فراوانی در شناسایی منشأ بافتی و گونه ای نمونه های گوشتی دارد (Stamoulis, Stamatis et al. 2010; Soares, Amaral et al. 2013).1-6-2- تکنیک های مبتنی برDNA ‏‎ ‎
با توجه به زمانبر بودن و مشکلاتی که در روش های تشخیصی مبتنی بر پروتئین وجود دارد، روش مبتنی بر DNA بر پایه PCR به علت سادگی، اختصاصیت و ویژه بودن و حساسیت این روش برای بررسی کیفیت و سلامت غذایی و تخمین ترکیبات غذایی مناسب تر است و می تواند جانشین مناسب تری برای روش های ایمنی شناسی موجود برای شناسایی گونه های گوشتی شود. مزیت دیگر PCR بر علاوه توانایی تمایز بین گونه های بسیار نزدیک در غذاهای ترکیبی و پیچیده مثل محصولات گوشتی ماریناد شده و حرارت دهی شده ، حتی می تواند برای تمایز منشأ بافتی درون گونه ای نیز استفاده شود (Meyer, Chardonnens et al. 1996).
تکنیک PCR با توجه به حساسیت ویژه و توانایی کابرد حتی در مقادیر بسیار اندک در محصولات خام و فرآوری شده و سرعت باعث می شود که روش های تکثیر DNA در بازبینی و بررسی موادغذایی، شناسایی مواد غذایی اصلاح ژنتیک شده و شناسایی تقلبات در فرآورده های غذایی کاربرد فراوانی داشته باشند (Mafra, Silva et al. 2008).
1-6-2-1-واکنش زنجیره پلیمراز (PCR)
1-6-2-1-الف-اطلاعات اولیه
این روش فوق العاده ساده بوده و با استفاده از تغییرات حرارت می‌توان چندین فرآیند را به دنبال همدیگر انجام داد. با این تکنیک می‌توان به عنوان یک روش قدرتمند تشخیص بالینی (Diagnostic) برای وجود موتاسیون‌ها در ژنوم انسانی، یا برای وارد کردن جهش‌های ویژه به داخل ژن همسانه شده، استفاده کرد. PCR بطور دستی و با قرار دادن پر زحمت و انتقال لوله‌های آزمایش بین حمام‌های آب دارای دمای لازم، بوجود آمد. امروزه دستگاه هایی بطور تجارتی تهیه می‌شوند که در آن ها جایگاه های لوله‌ای با بلوک فلزی حرارت پذیر تعبیه شده است و قابل برنامه ریزی برای تغییر سریع بین دماهای لازم است (Eckert and Kunkel 1991).
1-6-2-1-ب-تاریخچه
در گذشته معمولا از روش های شیمیایی برای تولید قطعات نوکلئوتیدی استفاده می‌کردند، اما این روش ها پر زحمت بوده و نیاز به مدت زمان طولانی داشتند از سال 1980 به بعد عمدتا از روش PCR در آزمایشگاه های زیست شناسی مولکولی استفاده می‌شود (Arnheim and Erlich 1992).
1-6-2-1-ج-مراحل PCR
مرحله دناتوراسیون:
DNA در مرحله اول برای مدت کوتاهی (30 ثانیه) قطعات DNAرا در درجه حرارت 94 درجه سانتی گراد حرارت می‌دهند تا دو زنجیره DNA از هم باز نشود.
مرحله آغازگر و مرحله اتصال دو قطعه نوکلئوتیدی:
این قطعات معمولاً از 25-18 باز آلی تشکیل می‌شوند و می‌توانند به قطعات مکمل خود که بر روی ژن مورد نظر قرار دارند، اتصال یابند. قطعه‌ای که در آن PCR به تعداد زیاد ساخته می‌شود، در واقع ما بین دو آغازگر قرار دارد. مرحله اتصال آغازگرها کوتاه بوده و حدوداً 30 ثانیه در دمای 65-30 درجه سانتیگراد صورت می‌گیرد.
مرحله پلیمریزاسیون یا مرحله سنتز:
در این مرحله با دخالت آنزیم DNA پلیمر از بر روی رشته DNA الگو. سنتز DNA با استفاده از نوکلئوتید تری فسفات‌هایی که در محلول وجود دارند، صورت می‌گیرد و برای سنتز DNA همیشه یک رشته DNA به صورت الگو و یک قطعه پلی نوکلئوتیدی به عنوان آغازگر مورد نیاز است. مراحل کلی PCR در شکل 1-3 شنان داده شده است.
ادامه PCR بعد از چرخه اول:
بعد از این 3 مرحله ، چرخه اول تمام می‌شود، چرخه‌های بعدی تکرار چرخه اول است. بدین صورت به دنبال چرخه‌های متعدد PCR قطعه DNA مورد نظر بطور تصاعدی افزایش می‌یابد. یعنی از 20 چرخه، ژن مورد نظر دارای بیش از 250 هزار خواهد بود. بنابراین روش PCR روش کارا در ازدیاد یک قطعه از DNA است (Innis, Gelfand et al. 1990).

شکل1-3-مراحل مختلف تکنیک PCR
1-6-2-1-د-کاربردهای مهم PCR
تهیه نسخه های متعدد از یک ژن مورد نظر: گاهی برای مطالعات بیولوژی مولکولی لازم است که یک ژن با نسخه‌های نسبتاً زیاد در دسترس باشد. بدین منظور می‌توان با استفاده از روش PCR ژن مورد نظر را در مقایسه با بقیه ژن‌ها تکثیر نمود (Zhang and Zhang 2002).
بررسی حضور یا عدم حضور یک ژن: با استفاده از این روش می‌توان تشخیص داد که آیا یک ژن در یک سلول حضور دارد یا نه؟ گاهی نیز از این مطالعات برای بررسی وجود ژن های مختلف باکتری‌ها یا ویروس‌ها در بدن افراد استفاده می‌کنند.
تشخیص بیماری های قبل از تولد: با استفاده از PCR و بکار گرفتن آغازگرهای مربوط به یک ژن بیمار و آغازگرهای مربوط به ژن سالم آلل آن می‌توان از تولد کودکان دارای بیماری‌های ژنتیکی جلوگیری کرد. برای این کار بعد از لقاح تخمک در آزمایشگاه، بعد از رسیدن تخمک به حالت 10 سلولی، یک سلول را جدا کرده و با استفاده از آغازگرها از ژن مورد نظر PCR صورت می‌گیرد، اگر بعد از PCR منحصراً ژن سالم تکثیر پیدا کرد، این مفهوم هموزیگوت بودن سلول‌های جنینی و سالم بودن آن هاست.
تعیین جنسیت جنین: معمولا چند تخمک با چند اسپرم در آزمایشگاه لقاح می‌یابند و سپس اجازه تکثیر به سلول تخم داده و با رسیدن تخم به مرحله ده سلولی، یکی از سلول‌ها را جدا کرده و بوسیله آغازگرهای ویژه مربوط به کروموزوم y مورد PCR قرار می‌گیرد. کروموزوم y منحصرا در سلول‌های نر دیده می‌شود. اگر قطعه تولید نشده در PCR بوسیله الکتروفورز و بطور دقیق‌تر توسط ساترن بلاتینگ تشخیص داده شد، جنین از نوع پسر و در غیر این صورت دارای کروموزوم‌های xx خواهد بود.
تشخیص بیماری ها: کشت میکروب ها که جهت تشخیص بیماری های عفونی در اکثر آزمایشگاه ها بکار می‌رود. زمان‌بر بوده و ثانیا باعث افزایش تعداد میکروب‌های بیماریزا و غیر بیماریزا در شرایط آزمایشگاهی می‌گردد. امروزه در برخی آزمایشگاه ها روش PCR جایگزین روش‌های کشت شده است. یعنی قطعه‌ای از ژن مربوط به میکروب بیماریزا مورد شناسایی قرار گرفته و آغازگرهای مربوط تولید می‌شوند، با استفاده از این آغازگرها می‌توان تشخیص داد که آیا ویروس ایدز در داخل بدن وجود دارد یا نه؟
1-6-2-1-ه-مشکل PCR و راه حل آن
اشکال PCR آلودگی نمونه‌های مورد بررسی توسط قطعات DNA خارجی است. اگر قبلا در داخل دستگاهی PCR یک نمونه انجام گرفته باشد. و ذره کوچکی از آن در داخل دستگاه باقی بماند. در PCR نمونه بعدی مشکل ایجاد خواهد کرد. برای رفع مشکل امروزه از ظروف یکبار مصرف استفاده می‌شود. کلیه ظروف قبل از استفاده اتوکلاو می‌شوند تا سلول‌ها و مولکولهای موجود در آنها، حتی‌الامکان غیر فعال می‌شوند.
1-6-2-1-و-روش های تغییریافته ‏PCR‏ و کاربرد این روش ها در شناسایی و درمان
تقسیم بندی های مختلفی برای تکنیک PCR در منایع مختلف وجود دارد که یکی از مهمترین تقسیم بندی ها در زیر آمده است. قابل ذکر است که simplex PCR در واقع همان PCR معمول و رایج است که در آن تنها از یک آغازگر استفاده شده است. در واقع واکنش زنجیره پلیمرازی است که در آن هدف تکثیر، ازدیاد و پیگیری تنها یک ژن با استفاده از یک آغاز گر می باشد.
‏1-6-2-1-الف-الف-مالتیپلکس پی سی آر (‏Multiplex-PCR‏)‏
‏ یکی از روش‌های تغییریافته ‏PCR‏ است که در آن تنها یک جایگاه ژنی مورد بررسی قرار می‌گیرد، با استفاده از پرایمرهای مختلف می‌توان چندین جایگاه را مورد بررسی قرار داد و از چندین جفت پرایمر اختصاصی جهت تکثیر استفاده می‌شود. کاربردهای این روش می‌تواند شامل موارد زیر باشد: ‏
‏1) بخش‌های بزرگی از یک ‏DNA‏ (هدف)، جهت جست‌وجوی تغییرات می‌تواند بررسی شود. برای مثال کشف نقص‌ها در بیماری دیستروفی عضلانی دوشن یا کشف بخش‌های مختلف ‏IS6110‎‏ و ‏IS986‎‏ در مایکروباکتریوم توبر کلوزیس عامل بیماری سل.
‏2) بخش‌های غیرمربوط به هم در ژنوم هدف می‌تواند مورد آزمایش واقع شود.
‏3) می‌توان از طریق این روش با پرایمرهای مختلف به جست‌وجوی عوامل مختلف پرداخت، مانند شناسایی عوامل شایع مننژیت. این روش بیشتر برای شناسایی جایگاه‌هایی از ژن‌ها به کار می‌رود که انواع زیادی از جهش در آن ها به وقوع می‌پیوندد (Edwards and Gibbs 1994).‏
1-6-2-1-الف-ب-آرتی-پی سی آر (‏RT-PCR‏)‏‏ این روش به ‏PCR‏ نسخه‌برداری معکوس نیز معروف است که ماده اولیه در آن ‏RNA‏ است. اولین مرحله در این روش تبدیل ‏RNA‏ به ‏DNA‏ توسط آنزیم نسخه‌بردار معکوس صورت می‌گیرد (‏RT‏). برخی از موجودات مانند برخی از ویروس‌های ‏RNAدار، ژنومشان تنها از ‏RNA‏ ساخته شده است. بعضی از ویروس‌ها مانند ویروس هپاتیت ‏B‏ هرگز به شکل ‏DNA‏ مابین در اثر آنزیم نسخه‌بردار معکوس درنمی‌آید. آنزیم نسخه‌بردار معکوس (‏RT‏) در این روش از "‏Avian Myeloblastosis Virus (AMV)‎‏" و "‏Moloney Murine Leu Kemia Virus (MMLV)‎‏ " به‌دست آمد.
کاربرد این آنزیم به‌دلیل آن‌که آنزیم به حرارت حساس بود در ابتدا پایین بود ولی با کشف باکتری به نام "ترموس ترموفیلوس" یک ‏DNA‏ پلیمر از مقاوم به نام (‏Tth‏) بهبود یافت که در حضور یون ‏Mn+2‎‏ دارای فعالیت نسخه‌برداری معکوس است و در دمای 72 درجه سانتیگراد توسط این آنزیم از روی ‏RNA، ‏DNA‏ ساخته می‌شود و سپس ‏Mn+2‎‏ اضافی توسط اتیلن گلیکول تترااستیک اسدی (‏EGTA‏) حذف می‌شود و سپس این آنزیم از ‏DNAای که خود ساخته استفاده و آن را تکثیر می‌کند (Freeman, Walker et al. 1999).‏
1-6-2-1-الف-ج-آرمز پی سی آر (‏ARMS-PCR‏)‏‏ این روش تکثیری قدرتمند برای مشخص کردن جهش‌های نقطه‌ای است. در این روش از پرایمرهای جهش یافته و طبیعی در دو لوله جداگانه استفاده می‌شود. اگر عمل پلیمریزاسیون در لوله حاوی پرایمر طبیعی انجام شود، نشان‌دهنده نبود جهش نقطه‌ای در باز مورد نظر است و اگر عمل پلیمریزاسیون در لوله‌ حاوی پرایمر جهش یافته انجام شود، نشان‌دهنده حضور جهش نقطه‌ای در باز مورد نظر است. این روش نام‌های دیگری نیز دارد از جمله ‏MAMA-PCR‏ مخفف ‏Amplificatin Multation Assay‏ ‏Mismatch‏ و ‏COP-PCR‏ مخفف ‏Competitive Oligonucleotide Primming‏ (Lajin, Alachkar et al. 2012). ‏
1-6-2-1-الف-د-نستد پی سی آر (‏Nested-PCR‏)
در این روش از دو جفت پرایمر استفاده می‌شود، طوری که جفت دوم در جفت اول جای می‌گیرد. در این روش ابتدا پرایمر بیرونی توالی هدف در طول 30-15 چرخه تکثیر می‌شود، سپس محصول ‏PCR‏ حاصل به لوله‌ای دیگر منتقل می‌شود و به‌عنوان الگو و با استفاده از جفت پرایمر داخلی مرحله دوم ‏PCR‏ انجام شده و ترادف کوچکتری از ‏DNA‏ که درون ‏PCR‏ اولی است، به اندازه 40-15 چرخه تکثیر می‌شود.‏
مزایای این روش تغییر یافته ‏PCR‏ عبارت است از: 1) نیاز به پروب (کاوشگر) و تأییدهای بعدی کمتر است، 2) حساسیت در این روش به میزان زیادی بالاتر است و 3) به دلیل انتقال محصول ‏PCR‏ دور اول به لوله جدید، ممانعت کننده‌ها رقیق می‌شود (Massung, Slater et al. 1998).
1-6-2-1-الف-ه-Real-Time PCR
به علت ورود نسل جدیدی از ترموسایکلرها با سیستم فلورومتری که اجازه پایش پیوسته خاصیت فلوئورسانس محصول ‏PCR‏ در زمان جمع شدن را می‌دهد، این روش ابداع شد. در این روش از کاوشگرها یا پروب‌های هیبریداسیون نشان‌دار شده با رنگ‌های فلورسانس در انتهای 5 یا 3 استفاده می‌شود. که امکان پایش پیوسته محصول ‏PCR‏ را بدون جداسازی آن ها در روش‌های الکتروفورز در ژل آگارز یا ژل پلی آکریل آمید می‌دهد. این سیستم در سال 1992 کشف شد. این روش به دلیل کاهش زمان سیکل‌های ‏PCR، حذف مرحله ‏Post-PCR‏ و کاربرد نشانگرهای فلوروژنیک و روش‌های حساس آشکارسازی تابش آن ها باعث افزایش سرعت این سیستم نسبت به سیستم ‏PCR‏ معمولی شده است. سازندگان و کاربران این روش سعی می‌کنند محصول ‏PCR‏ کوچک‌تر طراحی کنند تا سرعت افزایش یابد اما تجربه نشان داده که کاهش اندازه محصول لزوماً بازده ‏PCR‏ را بهینه نمی‌کند. البته این روش دارای معایبی نیز است از جمله می‌توان به عدم ناتوانی در مشخص کردن اندازه محصول بدون باز کردن سیستم و ناسازگار بودن برخی پلت فرم‌ها با شیمی برخی رنگ‌های فلورژنیک اشاره کرد (Dorak 2007).
1-7-پیشینه تحقیق
شناسایی گونه های حیوانی وگیاهی استفاده شده در فرآورده های پروتئینی مورد مصرف انسان و خوراک دام و طیور به لحاظ اقتصادی، عقاید مذهبی و بهداشتی بسیار حائز اهمیت می باشند. بیماری هایی چون جنون گاوی و آنفولانزای مرغی، سوء استفاده بعضی تولیدکنندگان مواد غذایی، دلایل مذهبی، حساسیت ها (آلرژی های) غذایی و غذاهای ترانس ژنتیک (GMOs) باعث افزایش نگرانی مردم در خصوص ترکیبات محصولات غذا یی شده است. گاهی اوقات برچسب محصولات غذایی تضمین کافی و درستی را از ترکیب واقعی خوراک ها نمی دهند، لذا لازم است روش هایی برای تعیین و تصدیق ترکیبات خوراک وجود داشته باشد تا هم مصرف کنندگان و هم تولید کنندگان در برابر تعویض و تقلبات غیر قانونی و تخلفات خاموش احتمالی حمایت گردند.
در این میان DNA میتوکندری به سبب برتری هایی که دارد، برای مطالعات تشخیص گونه و تشخیص تقلب در محصولات فرآوری شدۀ صنعتی و خوراک دام و طیور نسبت به DNAژنومی ارجح است. مطالعات نشان دهنده تکنیک های متعدد دیگری جهت بررسی صحت مواد غذایی گوشتی استفاده شده است (Tartaglia, Saulle et al. 1998).
1-7-1-پیشنه مطالعاتی در کشور ایران
جاهد خانیکی و همکاران در سال 1383 با توجه به تفاوت رنگ آمیزی بین بافت سویا و گوشت متوجه تقلبات شدند. در این مطالعه از یکی از رنگ آمیزی هایی که در آزمایشگاه های بافت شناسی معمول می باشد برای تشخیص تقلبات استفاده شد، این روش رنگ آمیزی هماتوکسیلین و ائوزین است. در این ارتباط ۸۰ نمونه از همبرگرهای خام منجمد از فروشگاه های مواد غذایی خریداری شد. نمونه ها در شرایط مناسب به آزمایشگاه بافت شناسی ارسال شد. سپس نمونه برداری و آزمایش بافت شناسی با رنگ آمیزی هماتوکسیلین و ائوزین انجام گرفت. در میکروگراف های تهیه شده، بافت سویا با رنگ قرمز مشاهده شد ولی سلول های لایه پالیسادینگ با رنگ روشن و دارای تلالوی خاصی دیده شدند. مواد پروتئینی داخل سلول های کوتیلدون سویا به رنگ قرمز و جدار کربوهیدارته سلول به رنگ آبی مشاهده شدند. بافت اکسترودات سیلندری که در واقع همان سلول های کوتیلدونی دناتوره شده می باشند رنگ قرمز تیره به خود گرفته است و با توجه به ساختمان بافتی که دارد به خوبی از بافت عضلانی متمایز می گردد. در تمام نمونه های آزمایش شده بافت سویا مشاهده شد. لذا با توسل به روش های هیستولوژیکی، تشخیص سویا در همبرگر و تفکیک آن از بافت عضلانی امکان پذیر است (خانیکی و نوری 1383).
در روشی مشابه صادقی و همکاران نیز جهت بررسی وجود بافت های غیر مجاز در انواع سوسیس و کالباس عرضه شده در مراکز توزیع شهر کرمانشاه در طی سال 1387 تا 1388 از رنگ آمیزی استفاده شد. این مطالعه از نوع توصیفی- مقطعی و حجم نمونه ی منبع علمی مقاله 720 نمونه ی سوسیس و کالباس تهیه شده از مراکز توزیع شهر کرمانشاه بوده است که از نظر بافت های غیر مجاز مورد بررسی قرار گرفته است. پس از نمونه گیری، تهیه ی مقاطع بافتی و رنگ آمیزی انجام شد. تشخیص بافت ها به کمک میکروسکوپ و توسط متخصصین بافت شناس انجام گرفت. عضله ی اسکلتی در 2/96 درصد از نمونه ها وجود داشت و در 8/3 درصد نمونه ها یافت نشد در 8/30 درصد نمونه ها بافت چربی مشاهده شد. در 2/19 درصد نمونه ها عضله قلبی یافت شد. در 2/96 درصد نمونه ها غضروف و استخوان بالغ یافت شد. در 6/57 درصد نمونه ها استخوان نابالغ یافت شد. فراوانی حضور هر یک از بافت های طحال، مری، آئورت، غدد بزاقی، غدد ترشحی لوله ی گوارش، گره لنفاوی، مو، ریه و زبان 8/3 درصد بود. فراوانی حضور هر یک از بافت های پستان، اپیدرم پوست و عصب 7/7 درصد بود. فراوانی حضور بافت همبند و عضلات صاف هر کدام 27 درصد بود. فراوانی حضور حفره های خالی و رگ هر1/46 درصد بود. در 100 درصد نمونه ها بافت های گیاهی تشخیص داده شد (صادقی، خزاعی و همکاران 1390).
حسینی و همکاران با روش الایزا تقلبات موجود در همبرگر را از نظر وجود گوشت های غیر مجاز و حرام بررسی نمودند. با توجه به گرانی گوشت و امکان انجام انواع تقلبات ازجمله استفاده از گوشت های ارزان قیمت در این مطالعه نوع گوشت مورد استفاده درتولید 288 نمونه همبرگرتولید شده در کارخانجات فرآورده های گوشتی و 96 نمونه همبرگر دست ساز غیر صنعتی عرضه شده در سطح شهر تهران درسال 1386 به روش الیزای ساندویچی مورد بررسی قرار گرفت. نتایج حاصل از این مطالعه نشان داد در هیچ یک از نمونه های مورد آزمون از گوشت تک سمی وخوک در تولید محصول استفاده نشده است، ولی انواع اختلاط گوشت مرغ، گوسفند و گاو در نمونه ها مشاهده شد و 8/43 در صد نمونه های همبرگر صنعتی با فرمول پروانه ساخت و برچسب محصول مطابقت نداشتند (حسینی، برازندگان و همکاران 1388).
قوتی و همکارانش در مطالعه ای به شناسایی و ردیابی بقایای بافتی اسب سانان (اسب و الاق) در مواد غذایی و خوراک دام و طیور با استفاده از توالی Cytochrome-b پرداختند. بدین منظور از سوسیس، کالباس، گوشت چرخ کرده وپودر ماهی تولید کارخانه های مختلف به ترتیب تعداد 10، 10، 10 و 50 نمونه جمع آوری شد. استخراج DNA از نمونه ها به روش گوانیدین تیوسیانات - سیلیکاژل صورت گرفت. قطعه 144 جفت بازی از ناحیه Cytochrome-bتوالی DNA میتوکندری با استفاده از واکنش زنجیره ای پلیمراز و جفت آغازگر اختصاصی اسب سانان تکثیر شد. نتایج نشان دادند که نمونه های جمع آوری شده هیچگونه آلودگی به بقایای بافتی اسب سانان نداشتند (قوتی، نصیری و همکاران 1387).
در مطالعه ای دیگر قوتی رودسری و همکارانش به تشخیص تقلب در پودر ماهی با استفاده از توالی های ژنی 12 S rRNAو16 S rRNAاز DNA میتوکندری پرداختند. بدین منظور از پودر ماهی تولید کارخانه های مختلف تعداد 20 نمونه جمع آوری شد. استخراج DNAاز نمونه ها به روش گوانیدین تیوسیانات- سیلیکاژل صورت گرفت. قطعات 104، 183 و 290 جفت بازی به ترتیب برای نشخوار کنندگان (گاو، گوسفند و بز)، طیور (مرغ و بوقلمون) و خوک سانان (اهلی و وحشی) از نواحی ژنی 12S rRNAو 16S rRNA، DNA میتوکندریایی با استفاده از واکنش زنجیره ای پلیمراز به صورت Multiplex و آغازگرهای اختصاصی نشخوار کنندگان، طیور و خوک سانان تکثیر شد. نتایج نشان دادند که نمونه های پودر ماهی جمع آوری شده هیچگونه آلودگی به بقایای بافتی خوک سانان نداشتند. اما 75 درصد نمونه های جمع آوری شده آلودگی به بقایای بافتی نشخوارکنندگان و 55 درصد آلودگی به بقایای بافتی طیور را نشان دادند. همچنین میزان آلودگی مشترک بقایای بافتی نشخوار کنندگان و طیور در پودر ماهی 45 درصد برآورد شد (رودسری، نصیری و همکاران 1387).
پیرانی و همکارانش با استفاده از ژن سیتوکروم b میتوکندری به تشخیص همزمان گوشت گاو، گاومیش، گوسفند و بز به روش Multiplex-PCR پرداختند. در این تحقیق نمونه های گوشت از گونه های فوق الذکر جمع آوری شده و آسیاب گردید. استخراج DNA از ۲۵۰ میلی گرم گوشت هر نمونه انجام شد و کمیت و کیفیت آن به روش های مشاهده بر روی ژل و تست با اسپکتروفتومتر بررسی گردید. برای انجام واکنش زنجیرهای پلیمراز، آغازگرهایی طراحی شد که برای هر گونه قطعه متفاوتی از ژن سیتوکروم b تکثیر گردد.
واکنش زنجیره ای پلیمراز به صورت جداگانه و همچنین به طور همزمان با مخلوطی از آغازگرها انجام شد. نواحی تکثیر شده بر روی ژل آگارز ۲% الکتروفورز شده سپس توسط اتیدیوم برماید رنگآمیزی شده و نوارهای الگو بدست آمد. در این تحقیق نوارهای ۱۲۴،330، ۴۷۲ و ۵۸۵ جفت بازی به ترتیب نشانگر گونه های گاومیش، بز، گاو و گوسفند بود. تکثیر ناحیه مورد نظر از هر گونه بیانگر وجود گوشت آن گونه در مخلوط گوشت و یا فرآورده های پروتئینی بود (پیرانی و زرین قبایی ۱۳۸۸).
پرچمی نژاد در مطالعه ای از روش مولکولی جهت شناسایی گونه های گوشتی در سوسیس های صنعتی استفاده کردند. در این بررسی، از 10 نمونه سوسیس تولید شده از گوشت گاو در سطح استان تهران ‏نمونه برداری شد و پس از استخراج DNA از نمونه های گوشت خام (بز، الاغ، شتر، گاو و مرغ ‏) و سوسیس ها با آغازگرهای اختصاصی هر گونه آزمایش PCR‏ بر روی آن ها انجام گردید. نتایج حاصل از Multiplex PCR‏ ‏نمونه ها حاکی از این بود که در تمام نمونه های سوسیس، اجزای مرغ وجود دارد و فقط در 5 نمونه سوسیس علاوه بر اجزای مرغ، بقایای گوشت گاو هم مشاهده گردید. ولی نتایج توالی یابی نشان داد که در تمام نمونه ها گونه Gallus gallus jabouillei‏ وجود دارد و فقط در سه نمونه نتیجه توالی یابی به صورت multiple گزارش شد، یعنی گونه دیگری هم در آن وجود داشت که به وسیله توالی یابی مشخص نشد (پرچمی نژاد 1391).
1-7-2-پیشینه مطالعاتی در کشورهای دیگر
Koh و همکارانش از روش ایمنی-شیمیایی برای شناسایی و اندازه گیری کمّی گوشت پخته و خام و پروتئین سویا در مخلوط های گوشتی استفاده کردند. آنها از آنتی بادی های ویژه خرگوش بر علیه پروتئین های سویای renatured و پروتئین های ماهیچه اسکلتی گاو استفاده نمودند (Koh 1978).
یکی از اولین تحقیقاتی که برای شناسایی پروتئین های سویا در مخلوط های گوشت و سویا مورد استفاده قرار گرفت روش ساده و حساس آنزیماتیک بود که توسط Morrissey و همکارانش معرفی شد. در این روش مخلوط گوشت-سویا با اسید رقیق دستخوش هیدرولیز اسیدی می شدند و در حضور گالاکتوز-دهیدروژناز، گالاکتوز و آرابینوز حاصل می گردید که میزان این دو قند در اشکال مختلف آرد و کنسانتره و ایزوله µM/1g 66 به بالاست در حالی که در گوشت گاو و خوک این کمتر از µM/1g 1 از محصول خام است. این روش برای اندازه گیری کیفی سویا در فرآورده های گوشتی مناسب است. حرارت دهی ˚c 100 در مدت زمان بالای 60 دقیقه باعث افت آزاد شدن گالاکتوز و آرابینوز گردید (Morrisey, Olbrantz et al. 1982).
در مطالعه دیگری Janssen و همکارانش با استفاده از روش blotting و dot blot به شناسایی پروتئین های سویا در فرآورده های گوشتی حرارت دیده پرداختند. در این روش پروتئین های سویا (ایزوله، کنسانتره و بافت شده) توسط الکتروفورز SDS-PAGE جداسازی گردید. سپس پروتئین های جدا شده را بر روی نیتروسلولز خشک و بعد با یک سیستم انتخابی ایمونوپراکسیداز رنگ شدند. با گسترش رنگ کردن با پراکسیداز، فراکسیون آنتی ژنتیک سویا مرئی گشت در حالی که پروتئین گوشت رنگی نشد. الگوی به دست آمده شاهدی قوی بر حضور سویا در فرآورده های گوشتی بود (Janssen, Voortman et al. 1986).
همچنین در مطالعه ای James و همکارانش از Multiplex-PCR برای شناسایی هم زمان سویا، ذرت وکانولای اصلاح ژنتیک شده (GM) و ژن های هدف کنترل داخلی سویا و ذرت و کانولا با 3 بار تکرار استفاده کردند (James, Schmidt et al. 2003).
در سال 2006 Kakihara و همکارانش، استخراج و شناسایی DNA سویا از مواد غذایی تخمیرشده (سویای تخمیر شده (natto) و سویا سس) را با دو روش CTAB و لیز کننده قلیایی استخراج کرد که در روش دوم خلوصDNA ناکافی بود. DNA استخراجی به روش PCR تکثیر شد که در نتیجه قطعه bp 100 با استفاده از جفت آغازگر ویژه سویا حاصل گشت (Kakihara, Matsufuji et al. 2006).از سال 2009 بر پایه ایده Koh، مطالعاتی برای جستجو و شناسایی پروتئین های سویا در فرآورده های گوشتی استریل با استفاده از روش های الایزا انجام شدند. یکی از مطالعات روش الایزایIndirect Competitive استفاده شده بود که توسط Renčová و همکارانش انجام شد. در این مطالعه آنها موفق به تأیید وجود سویا برخلاف ترکیبات اعلام شده بر روی برچسب فرآورده بودند (Renčová and Tremlová 2009).
یکی از روش هایی که مناسب گوشت های حرارت داده شده است، ولی حساسیت شناسایی پایینی دارد و همچنین مدت زمان انجام آن نیز طولانی تر است توسط Leo و همکارانش معرفی شد. آنها با آنالیز پروتئین سویا و کروماتوگرافی تعویض یونی و با جداسازی پپتیدهای مشخص سویا به شناسایی پروتئین های سویا در گوشت های حرارت دهی شده پرداختند. آنها ابتدا پپتیدهای مشخص سویا را با آنزیم تریپسین از پروتئین سویا استخراج کردند و سپس توسط کروماتوگرافی تبادل یونی آن ها را از هم جداسازی نمودند.
Silvia و همکارانش با استفاده از ساخت آنتی سرم آلبومین گوشت گاو، مرغ، خوک و اسب به شناسایی گوشت گونه های حیوانی مختلف و شناسایی تقلبات 13 برند همبرگر شهر سائوپائولو برزیل پرداختند. نتایج بدست آمده از این مطالعه نشان داد که هیچ تقلبی از این 4 گوشت در همبرگر وجود نداشت (Macedo-Silva, Barbosa et al. 2000).
در مطالعه ای دیگر با استفاد از روش مشابه فوق Flores-Munguia و همکارانش تقلبات گونه های گوشتی گاو، خوک و اسب جایگزین در 23 نمونه همبرگر ( که بر روی برچسب همه آن ها 100٪ گوشت گاو درج شده بود) و 17 مورد سوسیس مکزیکی را مورد بررسی قرار دادند. با استخراج پروتئین ها و قرار دادن آن ها به همراه آنتی سرم بر روی اسلاید های شیشه ای آغشته به آگارز 1/0 و 1٪ ، خط رسوبی مشاهده شد که با قرارگیری اسلاید ها در مقابل یک صفحه تیره، باندهای سفیدی مشخص گردید که نشان دهنده نتایج مثبت بود. در واقع گوشت اسب در 9 مورد از نمونه های همبرگر و در 5 مورد از نمونه های سوسیس مکزیکی نیز گوشت اسب و خوک مشاهده شد، جالب اینکه بر روی برچسب هیچ یک وجود این گونه ها درج نشده بود (Flores‐Munguia,Bermudez‐Almada et al. 2000).

پاسخ دهید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *