منبع علمی مقاله user872

فصل چهارم: نتایج
1.4- مشخصات افراد شرکت کننده در این مطالعه 31
2.4- نتایج حاصل از بررسی ریسک فاکتورهای دخیل در رد پیوند کلیه
و مشخصات بیماران 31
3.4- نتایج حاصل از بررسی چندشکلی ژن CAT در افراد سالم
و بیماران پیوند کلیه 33
4.4- نتایج حاصل از بررسی چندشکلی ژن NQO1 در افراد سالم
و بیماران پیوند کلیه 34
5.4- مقایسه فراوانی ژنوتیپی و آللی بین دو گروه سالم و بیمار 35
6.4- مقایسه فراوانی ژنوتیپی و آللی بین بیماران با رد حاد پیوند
و بیماران فاقد رد حاد پیوند 36
7.4- بررسی ارتباط ژنوتیپهای ژن CAT و NQO1 با ریسک
فاکتورهای رد حاد پیوند کلیه 38
فصل پنجم: بحث و نتیجهگیری
بحث و نتیجهگیری 40
پیشنهادات 45
فهرست منابع و مأخذ 46
فهرست جداول
عنوان صفحه
جدول 1.3- 20
جدول 2.3- مواد مورد نیاز جهت تهیه مخلوط واکنش PCR 24
جدول 3.3- برنامه تنظیم شده برای واکنش PCR جهت تکثیر ژن NQO1 25
جدول 4.3- قطعات حاصل از هضم آنزیمی برای ژنوتیپهای
چندشکلی ژنتیکی NQO1 26
جدول 5.3- برنامه تنظیم شده برای واکنش PCR جهت تکثیر ژن CAT 26
جدول 6.3- قطعات حاصل از هضم آنزیمی برای ژنوتیپ های
چندشکلی ژنتیکی CAT 27
جدول 1.4- بررسی ریسک فاکتورهای دخیل در رد پیوند کلیه
و مشخصات بیماران 32
جدول 2.4- بررسی ریسک فاکتورهای کمی دخیل در رد پیوند کلیه
و مشخصات بیماران 33
جدول 3.4- مقایسه ژنوتیپ های ژن CAT در گروه سالم و بیمار پیوند کلیه 33
جدول 4.4- مقایسه ژنوتیپ های ژن NQO1 در گروه سالم و بیمار پیوند کلیه 34
جدول 5.4- آنالیز توزیع فراوانی های ژنوتیپی و آللی ژنCAT در بین گروه سالم
و بیماران پیوند کلیه 35
جدول 6.4- آنالیز توزیع فراوانی های ژنوتیپی و آللی ژنNQO1 در بین گروه سالم
و بیماران پیوند کلیه 35
عنوان صفحه
جدول 7.4- آنالیز توزیع فراوانی های ژنوتیپی و آللی در ژن CAT
در بین بیماران پیوند کلیه 37
جدول 8.4- آنالیز توزیع فراوانی های ژنوتیپی و آللی در ژن NQO1
در بین بیماران پیوند کلیه 37
جدول 9.4- اثر ریسک فاکتور منبع بافتی باژنوتیپ های ژنCAT 38
جدول 10.4- اثر ریسک فاکتور منبع بافتی باژنوتیپ های ژن NQO1 38
فهرست شکلها
عنوان صفحه
شکل 1.1- ساختار ژن CAT و چندشکلی ژنتیکی CAT C-262T 10
شکل 2.1- ساختار ژن NQO1 و چندشکلی ژنتیکی NQO1 C609T 11
شکل 1.3- نتایج حاصل از PCR-RFLP چندشکلی ژنتیکی CAT C-262T
قابل مشاهده بر روی ژل آگاروز 28
شکل 2.3- نتایج حاصل از PCR-RFLP چندشکلی ژنتیکی NQO1 C609T
قابل مشاهده بر روی ژل آگاروز 29
فصل اول

مقدمه
1.1-پیوند کلیه
پیوند کلیه به عنوان درمان انتخابی برای بیماران با مرحله نهایی بیماری کلیوی (ESRD) که از عوامل مختلف ناشی میشود، تبدیل شده است. ESRD نشانه ای برای پیوند کلیه است که در آن میزان فیلتراسیون گلومرولی کلیه به کمتر از ml/min 15 میرسد. پیامد های پیوند در طول سالهای اخیر به طور قابل توجهی بهبود یافته است. (Sayegh MH et al, 2004, Keith DS et al,2005)
پیوند کلیه یک انسان به انسان دیگر بنام Renal allograft نامیده میشود که دهندهی کلیه، انسان زنده (خویشاوند، غیر خویشاوند) یا جسد (عمومأ دچار مرگ مغزی) میباشد. (Phadke G et al, 2011) تا سال 1389 جمعیت بیماران دچار نارسایی کلیه در ایران 320 هزار نفر بوده است که 49% این بیماران از روش درمانی پیوند کلیه، 48% از روش دیالیز خونی و 3% از روش دیالیز صفاقی استفاده میکردند. (Zwieble William J et al, 2000)
برای پیشگیری و درمان پس زدگی عضو پیوندی از داروهای سرکوب کننده سیستم ایمنی استفاده میشود. این داروها انواع متنوعی دارند که هر کدام با مکانیسم جداگانهای باعث سرکوب سیستم ایمنی میشوند و با توجه به شرایط بیمار معمولا یک ترکیب سه دارویی یا دو دارویی برای بیمار تجویز میشود، معمولترین داروهایی که استفاده میشود شامل: ساندیمون، سل سپت، پردنیزولون و اف کا میباشد. به دلیل استفاده از این داروها گیرندگان پیوند کلیه در معرض ابتلا به عفونت و برخی از بدخیمیها میباشند، علاوه بر موارد ذکر شده ممکن است بافت پیوندی دچار پسزدگی شود برای پیشگیری از عوارض مطرح شده، قبل از پیوند آزمایشات کامل فیزیکی برای تشخیص و درمان مواردی که میتواند پس از عمل پیوند باعث بروز مشکلاتی در بیمار شود، انجام میگیرد. تعیین نوع بافت، گروه خون و آنتی بادی، برای تعیین هماهنگی بین بافت و سلولهای دهنده و گیرنده ضروری است. گیرنده پیوند در زمان پیوند نباید هیچ گونه عفونتی داشته باشد، زیرا پس از عمل به دلیل استفاده از دارو های سرکوب ایمنی در معرض خطر عفونت قرار دارد. (Cornell et al,2008) علم پیوند کلیه در نیم قرن گذشته به طور قابل توجهی پیشرفت کرده است که عمدتأ به دلیل درک بهتر سیستم ایمنی بدن در رد پیوند و مدیریت بهتر سرکوب سیستم ایمنی میباشد. (Morris PJ, 2004, Sayegh MH et al, 2004)
تهدید ایمنولوژیک پیوند کلیه قبل از پیوند شروع میشود و ناشی از اثرات سیستمیک مرگ مغزی دهنده یا ایسکمی- ریپرفیوژن حین عمل میباشد. ایسکمی به دنبال ریپرفیوژن بیان آنتی ژنهای HLA را بالا میبرد و باعث به راه افتادن آبشاری از کموکاینها، سیتوکینهای پیش التهابی و مولکولهای چسبنده در پیوند میشود. این افزایش آنتی ژنهای HLA، پاسخ ایمنی و نفوذ سلولی پیوند را تشدید میکند و هر دو این پاسخها خطر رد پیوند را افزایش میدهد. (Briscoe DM et al, 1998, Kim IK et al, 2008)
اولین پیوند کلیه در 17 ژوئن سال 1950 در Ruth Tucker، بر روی یک زن 44 ساله مبتلا به بیماری پلی- کیستیک کلیه انجام گرفت. کلیه اهدا شده 10 ماه بعد از پیوند رد شد به دلیل اینکه هیچ داروی سرکوب کننده سیستم ایمنی در آن زمان در دسترس نبود. اولین پیوند موفقیت آمیز کلیه، در سال 1954 در بوستون و پاریس در بیمارستان بریگهام توسط جوزف موری و همکارانش بر روی دو قلو های همسان (رونالد و ریچارد) انجام گرفت. (Petechuk D, 2006) اولین پیوند کلیه در ایران در سال 1346 شمسی در شیراز انجام شد. ( Wishart DS, 2008, Ghods AJ, 2002)
2.1-رد پیوند کلیه
رد پیوند همواره از موانع اصلی در پروسه پیوند بوده است. پیوند بافت یا سلول از یک دهنده که از نظر ژنتیکی با دریافت کننده پیوند متفاوت است باعث به وجود آمدن یک پاسخ ایمنی بر علیه آنتی ژن های فرد دهنده پیوند میشود که اگر کنترل نشود، این پاسخ ایمنی پیوند را از بین میبرد. رد پیوند ناشی از مکانیسمهای مختلف مرتبط با آنتی بادیها، سیستم کمپلمان، سلولهای T ودیگر انواع سلولها میباشد. انواع مختلف سلولها در پیوند به عنوان هدف توسط این واسطهها تحت تأثیر قرار میگیرند به خصوص سلولهای اندوتلیال و سلولهای توبولی. برخی از واسطههای التهابی، به عنوان مثال اینترفرون گاما میتواند حساسیت پیوند به آسیب را تغییر بدهد. رد پیوند را میتوان به وسیلهی تطبیق مولکولی بین دهنده و گیرنده و به وسیلهی استفاده از داروهای سرکوب کننده سیستم ایمنی بعد از پیوند کاهش داد. (Frohn C et al, 2001)رد پیوند یک پاسخ ایمنی تطبیقی است که از طریق ایمنی سلولی (بواسطه سلول های T کشنده و القاء آپوپتوز سلول های هدف) و همچنین ایمنی همورال (بواسطه فعال کردن سلول های B ترشح کننده آنتی بادی) انجام میگیرد که این اقدام توسط اجزای پاسخ ایمنی ذاتی (ماکروفاژ ها و پروتئین های ایمنی محلول) همراهی میشود.
3.1- رد حاد پیوند
رد حاد پیوند یک عارضه جدی و مهم بعد از پیوند است و یک عامل مهم در ایجاد رد مزمن پیوند محسوب می-شود. به نظر میرسد این پدیده دارای یک زمینهی ایمنولوژیک بوده و سیستم ایمنی نقش اساسی دارد. رایج-ترین شکل رد حاد پیوند زمانی آغاز میشود که آنتی ژنهای دهنده پیوند بوسیلهی سلولهای عرضه کننده آنتی ژن (APC) به لنفوسیتهای T در گیرنده عرضه شود. (Larsen CP et al, 1990) بیوپسی از کلیه پیوندی روش استاندارد برای تشخیص رد حاد است. رد حاد به طور سنتی بر اساس سرعت و شدت فرآیند rejection به گروههای hyper acute، accelerate acute و acute rejection طبقه بندی میشوند.
تشخیص رد حاد نه تنها متکی بر علائم و نشانههای بالینی در بیمار است، بکله بر اساس دادههای آزمایشگاهی چون بیوپسی بافت صورت میگیرد. آسیب شناس آزمایشگاه به طور کلی به دنبال سه نشانه اصلی بافت شناسی میگردد: 1- نفوذ سلول های T، که ممکن است با نفوذ ائوزینوفیلها، سلولهای پلاسما و نوتروفیلها همراه باشد، 2- سازش ساختار آناتومی بافت و 3- آسیب رگهای خونی. بیماران مبتلا به رد حاد سلولی، یک افزایش ناگهانی در کراتینین سرم، تجمع مایعات و گاهی اوقات تب و tenderness (حساس شدن به لمس) پیوند را نشان میدهند. با درمان فعلی بروز رد حاد در سال اول پس از پیوند تقریبأ 10-5 % میباشد. از لحاظ پاتولوژیکی رد حاد با تجمع سلولهای تک هستهای در فضای بین توبولی همراه با التهاب در توبولها و گاهی اوقات در رگهای خونی تجلی مییابد. (Colvin RB et al, 2006) حملات رد حاد پیوند کلیه یک عامل خطر برای بقاء کوتاه مدت و بلند مدت پیوند در نظر گرفته میشود. (Pallardo LM et al, 2004) تعدادی از عوامل که بقاء کوتاه مدت پیوند را تحت تأثیر قرار میدهند عبارتند از: عملکرد تأخیری پیوند (DGF) ، آنتی بادی-های ضد HLA، نوع اهدا کننده پیوند، گروه خونی، افزایش سن دهنده و گیرنده پیوند، وزن گیرنده، فشار خون بالا، دیابت و... از عوامل خطر قابل توجه برای از دست دادن پیوند میباشند که برخی از این عوامل را به اختصار توضیح میدهیم.
4.1- DGF
از دست دادن پیوند به علت اختلال در عملکرد مزمن پیوند یک نگرانی عمده در دریافت کنندههای پیوند کلیه میباشد. (Briganti EM et al, 2002, Chapman JR et al,2005) وقوعDGF بیش از 3-2 هفته بعد از پیوند طول میکشد. علل اختلال عملکرد کلیه بسته به مدت زمان پس از پیوند، منبع ارگان زنده یا جسد، نوع سرکوب سیستم ایمنی، بیماری های زمینهای و... متفاوت است. تخمین زده شده که در 50-30 % از پیوندها اختلال در عملکرد در طول دوره اولیه پیوند گسترش مییابد. (Giral Class M et al, 1998) DGF را میتوان بسته به زمان پس از پیوند به دو نوع زودرس و تأخیری تقسیم کرد. اختلال عملکرد حاد یا تحت حاد کلیه با افزایش ناگهانی کراتینین سرم آشکار میشود. اختلال عملکرد تأخیری پیوند معمولأ 6 ماه پس از پیوند بروز میکند که با بالا رفتن به آرامی کراتینین سرم خودش را نشان میدهد. اغلب با پروتئنوری با درجه کم و فشار خون بالا همراه است و به میزان 4-2 % در هر سال اتفاق میافتد.
5.1- آنتی بادیهای ضد HLA
پاسخهای خود ایمنی عمدتأ بر علیه مولکول های سطح سلول که تحت عنوان مولکولهای MHC خوانده می-شوند، انجام میگیرد. مولکولهای MHC در انسان آنتیژن لکوسیت انسانی (HLA) نامیده میشوند. این مولکولها مسئول ارائه آنتیژنهای خار ج و داخل سلولی به سلولهای سیستم ایمنی از جمله سلولهای T هستند. سلولهای T قادرند مولکول MHC خارجی سلولهای پیوند (به طور مستقیم) یا بعد از پردازش مجدد در سطح گیرنده سلولهای عرضه کننده آنتیژن (غیر مستقیم) تشخیص بدهد. بدن به طور معمول به مولکول-های MHC که از قبل در بدن وجود داشته پاسخ نمیدهد مگر اینکه از طریق بارداری، انتقال خون یا پیوند در معرض سلولهای خارجی قرار بگیرند. هر چه میزان سازگاری مولکولهای MHC دهنده با گیرنده بیشتر باشد سیستم ایمنی میزبان کمتر تحریک شده و پایداری بافت افزایش مییابد. (Morris PJ et al, 2004) اهمیت آنتیژنهای MHC در انسان بدیهی است به طوری که میزان طول عمر بقای پیوند در پیوندهای خواهر برادری با HLA مشابه به طور قابل توجهی بالاتر از پیوند خواهر برادری با HLA غیرمشابه میباشد. (Nankivell BJ et al, 2010) تقریبأ 25 % از رد حاد به علت آنتیبادی علیه آنتیژنهای HLA دهنده صورت میگیرد. (Colvin RB, 2007)
6.1- آنتی بادی علیه آنتی ژنهای گروه خونی
در پیوند کلیه، گروه خونی دهنده کلیه به طور معمول با گروه خونی گیرنده سازگار است. با این حال، پیوند کلیه در گیرندههایی که با فرد دهنده از نظر گروه خونی ناسازگاراند نیز با موفقیت، با استفاده از یک پروتکل تجربی پلاسمافرز یا immunoadsorption که مستلزم حذف آنتیبادی در گیرنده پیوند بعد از عمل است، صورت میگیرد. پس از حذف، آنتی بادیهای ضد گروه خونی به سطح قبل از پیوند افزایش مییابند. (Lynch RJ et al, 2008)
7.1- افزایش سن اهداکننده و دریافت کننده پیوند
در مطالعهای که در سال 2010 بر روی عوامل خطر مؤثر در از دست رفتن پیوند انجام شد، نتایج نشان داد که سن اهدا کننده یک عامل پیش آگهی و قابل توجه برای از دست رفتن پیوند است، بدین صورت که با افزایش یک سال در سن دهنده، خطر نسبی از دست رفتن پیوند 05/1 برابر افزایش مییابد. (Khalkhali HR et al, 2010)
8.1- اهدا کننده بافت
اینکه بافت پیوندی از فرد زنده دریافت شده باشد یا از فرد دچار مرگ مغزی، در بقای طولانی مدت پیوند تأثیر-گذار خواهد بود. به طوری که در بیمارانی که از فرد زنده و به خصوص از خویشاوندان درجه اول بافت میگیرند رد پیوند کاهش مییابد. تا سال 1387 در حدود 95-90 % پیوندها از اهدا کنندگان زنده و 5 تا 10 درصد آن از طریق پیوند از جسد انجام میگرفت، در حال حاضر، 96 درصد پیوندها از جسد و تنها حدود 4 درصد از پیوندها از اهدا کننده زنده دریافت میشود. همچنین مطالعات انجام شده در این خصوص حاکی از آن است که حدود 50-20 %، وقوع DGF در بیمارانی که از جسد بافت دریافت میکنند افزایش مییابد که ناشی از اثرات سیستمیک مرگ مغزی دهنده یا آسیب اسیکمی- ریپرفیوژن حین عمل میباشد.
(Nankivell BJ et al, 2010, Giral Classe M et al,1998)
9.1- استرس اکسیداتیو و آنتی اکسیدانت ها
استرس اکسیداتیو در نتیجهی افزایش غلظت گونههای فعال اکسیژن (ROS) و یا کاهش آنتی اکسیدانتها صورت میگیرد. (Crawford DA et al, 2011) که نشان دهندهی عدم تعادل در میزان تولید رادیکالهای آزاد و توانایی سیستم دفاع آنتی اکسیدانی در رفع واسطههای واکنش (ROS) و یا ترمیم آسیب به وجود آمده می-باشد. اثرات سمی ناشی از استرس اکسیداتیو که از طریق تولید پراکسیدها و رادیکالهای آزاد ایجاد میشود به تمام اجزای سلول از جمله: پروتئینها، لیپیدها و DNA آسیب میرساند. علاوه بر این، گونههای فعال اکسیژن به عنوان یک عامل پیامرسان در سیگنالینگ اکسید و احیاء عمل میکنند، بنابراین استرس اکسیداتیو میتواند باعث اختلال در مکانیسمهای طبیعی سیگنالینگ سلولی شود.
در انسان استرس اکسیداتیو در توسعه سرطان (BarryH , 2007)، بیماری پارکینسون و آلزایمر (Valko M et al, 2007)، آترواسکلروز، نارسایی قلبی (Singh N et al, 1995)، سندرم x شکننده (Diego-Otero Y et al, 2009)، بیماری خونی سلول داسی شکل (Amer J et al, 2006) و چند بیماری دیگر دخیل است. استرس اکسیداتیو شدیدتر میتواند باعث مرگ سلولها شود، استرس اکسیداتیو در حد متوسط میتواند آپوپتوز را آغاز کند، در حالیکه تنشها شدیدتر باشد ممکن است باعث نکروز شدن گردد. (Lennon SV et al, 1991) برای حفظ عملکرد سلولی در برابر ROS، سلولها سیستم دفاعی آنزیمی (به عنوان مثال: سوپر اکسید دیسموتاز، کاتالاز و گلوتاتیون پراکسیداز) و غیر آنزیمی (به عنوان مثال: گلوتاتیون و ویتامین هایی با نقش آنتی اکسیدان مثل ویتامین C و E) دارند که به وسیله ی آن ROS راسم زدایی میکنند. (Abdollahi M et al, 2004)
10.1- کاتالاز
کاتالاز آنزیم مشترک در تقریبأ تمام موجودات زنده هوازی میباشد که تجزیه پراکسید هیدروژن (H2O2) به آب و اکسیژن را کاتالیز میکند. (Chelikani P et al, 2004) کاتالاز مجموعهای از چهار زیر واحد یکسان (تترامر) است که هر زیر واحد آن دارای وزن مولکولی در حدود 60 کیلو دالتون میباشد و هر زیر واحد دارای یک گروه هِم میباشد. (Nagem R et al, 1999)
ژن کاتالاز 34 کیلو جفت باز طول دارد و شامل 12 اینترون و 13 اگزون می باشد. بخش پروموتر ژن کاتالاز غنی از GC و فاقد جعبهی TATA میباشد. ژن کاتالاز انسان بر روی بازوی کوتاه کروموزوم شماره 11 در موقعیت 13 این ژن (13P11) قرار گرفته است. (Quan F et al, 1986) تومور ویلمز (Wilm’s Tumor) یک نئوپلاسم رایج دوران کودکی است که با حذف در اطراف باند 13P کروموزوم 11 همراه است. در بعضی از افراد حذف با کاهش فعالیت آنزیم کاتالاز همراه است. در بافت پستانداران بالاترین سطح آنزیم کاتالاز در کبد، کلیه و گلبول های قرمز و پایین ترین سطح آن در بافت همبند یافت میشود. Shinga و همکارانش گزارش کردند که در سلولهای عضله صاف عروق و سلول های اندوتلیال آنزیم کاتالاز فاقد فعالیت میباشد. در بافت کبد کاتالاز به طور غالب در پراکسیزومها و در اریتروسیتهای بالغ بصورت آزاد در سیتوزول وجود دارد. (Quan F et al, 1986)
تجزیه پراکسید هیدروژن به آب و اکسیژن بوسیله ی آنزیم کاتالاز، یک فرآیند دو مرحلهای است:
1)H2O2 + Fe(III)-E → H2O + O=Fe(IV)-E
2) H2O2 + O=Fe(IV)-E → H2O + Fe(III)-E + O2
با وارد شدن پراکسید هیدروژن به جایگاه فعال آنزیم کاتالاز، با اسید آمینه های 147Asn و 74His برهمکنش میکند و باعث انتقال پروتون (یون هیدروژن) بین اتم های اکسیژن میشود که این انتقال یون هیدروژن به اتم-های اکسیژن آزاد سبب تشکیل یک مولکول آب میشود و Fe3+ به Fe4+ تبدیل میشود. Fe4+ با دومین مولکول هیدروژن پراکسید واکنش داده، آب و اکسیژن تولید میکند و به Fe3+ تبدیل میشود. (Vetrano AM et al, 2005)
تعدادی جهش و چند شکلی در ژن کاتالاز گزارش شده که بیشتر آنها با آکاتالاسمیا که یک صفت آتوزومال غالب بوده و سطح آنزیم کاتالاز گلبولهای قرمز 2/0-4 % بالاتر از حد نرمال است، همراه میباشد. (Ogata M, 1991)
چند شکلی که در این مطالعه مورد بررسی قرار دادیم، جایگزینی باز سیتوزین به تیمین در موقعیت 262- پروموتر ژن کاتالاز بود که افراد حامل آلل T (CT, TT) نسبت به افراد هموزیگوت برای آلل C(CC) به طور قابل توجهی سطح کمتری از آنزیم کاتالاز را نشان میدهند. (Ahn J et al, 2006)
ساختار ژن CAT و جایگاه چند شکلی مورد نظر در شکل زیر آمده است.

شکل 1.1- ساختار ژن CAT و چندشکلی ژنتیکی CATC-262T
11.1-NAD(P)H کوئینون اکسیدوردوکتاز1 (NQO1)
NQO1 یک آنزیم سیتوزولی است که قبلأ تحت عنوان DT-diaphorase نامیده میشد، از آنزیمهای مهم در متابولیسم زنوبیوتیکها به شمار میآید. این آنزیم احیاء دو اکترونی ترکیبات quinoid به هیدروکوئینون را کاتالیز میکند. از تولید رادیکالهای آزاد و گونه های فعال اکسیژنی جلوگیری میکند، در نتیجه از سلولها در برابر آسیب اکسیداتیو محافظت میکند. همچنین فعال سازی برخی از مواد زیست محیطی پیش ساز سرطان موجود در دود توتون و تنباکو مانند ترکیبات نیتروآروماتیک و آمین های هتروسیکلیک را کاتالیز میکند. (Chen H et al, 1999)
ژن این آنزیم بر روی موقعیت 22 بازوی بلند کروموزوم شماره 6 (22q16) قرار دارد. طول این ژن 20 کیلو جفت باز است که 5 اینترون و 6 اگزون را در خود جای داده است. (Ernster L,1987)
چند شکلی مورد بررسی در این مطالعه مربوط به جایگزینی اسید آمینههای سیتوزین به تیمین در موقعیت 609 اگزون شماره 6 ژن NQO1 میباشد که اسید آمینه پرولین جایگزین سرین میشود. (Wiencke JK et al, 1997) این جهش با کاهش فعالیت آنزیم همراه است و در 25-13 % ازجمعیت سفید پوستان دیده میشود. (Chen H et al, 1999) به طوری که آنزیم NQO1 در افرادی که ژنوتیپ TT دارند، یا فاقد فعالیت است یا فعالیت کمی دارد.(Siegel D et al, 1999) و افرادی که ژنوتیپ هتروزیگوت (CT) دارند تقریبأ نیمی از فعالیت آنزیم را دارند.
در شکل زیر ساختار و جایگاه چند شکلی ژنتیکی ژن NQO1 آمده است:

شکل 2.1- ساختار ژن NQO1 و چند شکلی ژنتیکی NQO1 C609T
12.1- هدف
از آنجا که رد حاد پیوند در حفظ بافت بصورت کوتاه مدت و بلند مدت دارای اهمیت است، مطالعات بسیاری بر روی عوامل ایمنی و غیر ایمنی مؤثر در رد حاد پیوند انجام گرفته است. چند شکلی ژنتیکی تک نوکلئوتیدی (SNP) از معمولترین تنوعات ژنتیکی در ژنوم انسان هستند و پتانسیل زیادی برای کاربرد در بررسی رابطه آن با تعدادی از بیماریها دارد. رادیکالهای آزاد اکسیژن به عنوان واسطههای پاتولوژیک در بسیاری از بیماری-ها دخیل هستند. استرس اکسیداتیو با پیشرفت بسیاری از بیماریها از جمله سرطان، بیماریهای عصبی، دیابت و بیماری مزمن کلیوی مرتبط است.یکی از سیستمهای دفاعی علیه آسیبهای ناشی از استرس اکسیداتیو در انسان آنزیم کاتالاز و NQO1 میباشد،از آنجا که استرس اکسیداتیو می تواند در نکروز شدن بافت تأثیر بگذارد، بر آن شدیم تا یک SNP در ژن CAT و یک SNP در اگزون 6 ژن NQO1 را بررسی کنیم. این مطالعه جهت بررسی ارتباط پلی مورفیسمC-262T ژن کاتالاز وC609T ژن NQO1 با رد حاد پیوند کلیه در بیماران دریافت کنندهی کلیهی پیوندی میباشد.
13.1- فرضیه
ژنوتیپTT و CTنسبت به ژنوتیپ CC در چند شکلی ژنتیکی C-262T ژن CAT خطر رد حاد پیوند کلیه را افزایش میدهد.
با افزایش آلل T در ژن CAT، خطر رد حاد پیوند کلیه افزایش مییابد.
ژنوتیپ TT و TC از چند شکلی ژنتیکی C609T ژن NQO1 درمقایسه با ژنوتیپ CC خطر رد حاد پیوند کلیه را افزایش میدهد.
با افزایش آلل T در ژن NQO1، خطر رد حاد پیوند کلیه افزایش مییابد.
فصل دوم

مروری بر تحقیقات پیشین
1.2- مطالعات انجام شده بر روی ژن کاتالاز
مطالعات بسیاری بر روی ژن کاتالاز و رابطه چند شکلیهای ژنتیکی آن با بیماریهای مختلف انجام گرفته است که به شرح زیر میباشد:
مطالعهای در سال 2009 توسط Piort Galecki و همکارانش بر روی ارتباط بین پلی مورفیسم عملکردی ژن CAT(C-262T) و احتمال افسردگی راجعه صورت گرفت که نتایج بدست آمده نشان داد هیچ ارتباط معنی-داری بین پلی مورفیسم ژن کاتالاز و خطر ابتلا به افسردگی وجود ندارد. (Galecki P et al, 2009)
در مطالعه ای که توسط Ozbay و همکارانش در سال 2011 بر روی ارتباط بین سطح آنزیمهای آنتی اکسیدانت خون و زمان حمله میگرن در بیماران مبتلا به میگرن انجام شد، کاهش آماری قابل توجهی در فعالیت GST-PX، CAT، SOD و سطوح GSH در بیماران مبتلا به میگرن در مقایسه با گروه شاهد مشاهده شد.(CAT, GSH P<0/001, GSH, SOD P<0/05) در بیماران مبتلا به میگرن و گروه شاهد تفاوت معنیداری برای ژنوتیپهای Mn-SOD و CAT مشاهده نشد اما در ژنوتیپ GSH-PX3 تفاوت معنیدار وجود داشت. تفاوتی در فراوانی آللی Mn-SOD، CAT و GHS-PX3 در بین بیماران و گروه شاهد نبود. در نتیجه آنزیمهای استرس اکسیداتیو و آنتی اکسیدانت ها ممکن است نقش مهمی در پاتوژنز میگرن ایفا کنند. (Ozbey U et al, 2011)
در مطالعهای که توسط Ahn و همکارانش در سال 2005 در خصوص ارتباط خطر سرطان سینه و ژنوتیپ کاتالاز و استفاده از میوه و سبزیجات و مکمل های غذایی در جزیره لانگ انجام شد نشان داد که فعالیت بالای ژنوتیپ CC ژن کاتالاز با کاهش 17 % خطر ابتلا به سرطان سینه در مقایسه با افرادی که حداقل یک آلل T دارند (TT,CT) مشاهده شد. (AhnJ et al, 2005)
در مطالعه ای که توسط Ji-Yeob Choi و همکاران درسال 2007 در بررسی پلی مورفیسمهای Ala16Val ژن Mn-SOD، C-262T ژن CAT و Pro200Lue ژن GPX1 و خطر ابتلا به سرطان پروستات بر روی مردان با سابقه کشیدن سیگار یا قرار گرفتن در معرض آزبست بودنند انجام شد، هیچ ارتباطی بین ژنوتیپهای Mn-SOD، CAT و GPX1 و خطر ابتلا به سرطان پروستات دیده نشد. (Choi JY et al, 2007)
در مطالعهای که توسط CristianoCapurso و همکارانش در سال 2008 در ارتباط با رابطه چند شکلی C-262T ژن CAT و بیماری آلزایمر انجام شد ، هیچ ارتباطی بین بیماری آلزایمر و این چند شکلی مشاهده نشد. (Capurso C et al, 2008)
در مطالعهای که توسط Zarbock و همکارانش در سال 2007 در ارتباط با خطر بیماری پسودوگزانتوما- الاستیکوم و چند شکلی ژنتیکی C-262T ژن CAT انجام شد، نشان داد که آلل C در این چند شکلی خطر ابتلا به این بیماری را افزایش میدهد. (Zarbock R et al, 2007)
در مطالعهای که توسط Chistiako و همکارانش در سال 2006 در رابطه با پلی مورفیسم T>C262 پروموتر ژن کاتالاز و ارتباط آن با نوروپاتی دیابتی نوع 1 در روسیه انجام شد، نتایج نشان داد که آللT 262- در ژن کاتالاز علیه توسعه سریع بیماری نوروپاتی دیابتی نوع1 نقش حفاظتی دارد. (Chistiako DA et al,2006)
در مطالعهای که توسط Chang Dong و همکارانش در سال 2012 در ارتباط با پلی مورفیسم CAT -21 A>T با سرطان کولورکتال انجام شد، تفاوت معنیداری بین ژنوتیپهای ژن CAT و همچنین فعالیت آنزیمی پایین تر در بیماران مبتلا به سرطان کولورکتال نسبت به گروه کنترل مشاهده شد. فعالیت کم آنزیم CAT با افزایش ریسک ابتلا به سرطان کولورکتال در ارتباط است، با این حال، هیچ مدرکی در حمایت از ارتباط پلی-مورفیسم CAT -21 A>T با خطر ابتلا به سرطان کولورکتال مشاهده نشد. (Chang D et al, 2012)
مطالعهای در سال 2006 توسط Mak و همکارانش در هنگ کنگ چین بر روی بیماران مبتلا به آسم و ارتباط آن با پلی مورفیسم CAT C-262T صورت گرفت که نشان داد، آلل T در جمعیت غیر سیگاری، در برابر بیماری آسم نقش حفاظتی دارد. (Mak et al, 2006)
مطالعهای در سال 2005 توسط Zhou و همکارانش بر روی دو SNP در پروموتر ژن کاتالاز و ارتباط آن با فشار خون بالا در سفیدپوستان و آمریکاییهای آفریقایی تبار انجام شد. اطلاعات بدست آمده نشان داد که تغییرات ژنتیکی در منطقه پروموتر ژن کاتالاز با استعداد ابتلا به فشار خون بالا در ارتباط است. (Zhou XF et al, 2005)
2.2- مطالعات انجام شده بر روی ژن NQO1
مطالعهای درسال 2003 توسط Lin Pو همکارانش در ارتباط با بررسی سه پلی مورفیسم ژنتیکی در ژنهای NQO1، گلوتاتیون S – ترانسفراز و سوپراکسیددیسموتاز با خطر ابتلا به سرطان ریه در تایوان انجام شد، نشان داد که به طور کلی پلی مورفیسم NQO1 و Mn-SOD با خطر ابتلا به سرطان ریه در ارتباط نیست. افراد حامل آلل نوع GSTP1 در معرض خطر بالای سرطان سلولهای سنگفرشی ریه هستند. با در نظر گرفتن عوامل خطری چون وضعیت سیگار کشیدن، جنسیت و نوع بافت بر روی این پلی مورفیسمها دیدند که نوع وحشی ژن NQO1 با سرطان ریه در افراد سیگاری همراه است. (Lin P er at,2003)
متا آنالیزی در سال 2013 توسط Zhu CL و همکارانش در رابطه با پلی مورفیسم C609T ژن NQO1 با سرطان دستگاه گوارش (DTC) انجام شد که به طور کلی از لحاظ آماری ارتباط معنی داری بین پلی مورفیسم این ژن وخطر DTC وجود دارد. (Zhu CL et al, 2013)
در سال 2013 توسط Hu Yanlig و همکارانش متا آنالیزی در ارتباط با بررسی پلی مورفیسم C609T ژن NQO1 و خطر ابتلا به سرطان مری انجام شد که نتایج بدست آمده نشان داد که ارتباط معنیداری بین ژنوتیپ مغلوب (TT) C609T، NQO1 و سرطان مری وجود دارد. (Yanlig H et al, 2013)
در مطالعهای که توسط Pandith A و همکارانش در سال 2011 در جمعیت کشمیری بر روی ارتباط بین چند شکلی ژنتیکی C609T ژن NQO1 و سرطان مثانه انجام شد، نشان داد که آلل T خطر ابتلا به سرطان مثانه را افزایش میدهد. (Pandith A et al, 2011)
مطالعهای دیگر در سال 2011 توسط Stavropoulou C و همکارانش در ارتباط با چند شکلی C609T ژن NQO1 و خطر ابتلا به بیماری های آلزایمر و پارکینسون انجام گرفت که در آن آلل T خطر ابتلا به این بیماری ها را افزایش میداد. (Stavropoulou C et al, 2011)
مطالعهای در سال 2013 توسط Liu و همکارانش در بررسی ارتباط پلی مورفیسم عملکردی NQO1 C609T و خطر ابتلا به سرطان سلولهای کبدی در جمعیت چین انجام شد. نتایج نشان داد در افرادی که ژنوتیپ TT دارند در مقایسه با افراد دارای ژنوتیپ CC به طور قابل توجهی خطر ابتلا به سرطان سلولهای کبدی افزایش مییابد. (Liu F et al, 2013)
متا آنالیزی در سال 2012 توسط Zhang و همکارانش در رابطه با پلی مورفیسم NQO1 C609T و خطر ابتلا به سرطان معده در آسیاییها انجام شد. نتایج حاصل از مقایسه آلل T و آلل C این ژن نشان داد که در افراد دارای آلل T نسبت به افراد دارای آلل C، به طور قابل توجهی شانس ابتلا به سرطان معده افزایش مییابد. (Zhang Y et al, 2012)

3.2- مطالعات پیشین انجام شده در خصوص پیوند کلیه
مطالعهای در سال 2011 توسط Amanda Crawford و همکارانش بر روی فعالیت آنزیمهای گلوتاتیون پراکسیداز، سوپراکسیددیسموتاز و کاتالاز و پیشرفت بیماری مزمن کلیوی CKD)) انجام شد. SNPهای مورد بررسی شامل: تبدیل اسید آمینه لوسین به پرولین(C>T) در موقعیت 197 ژن GPX1، تغییر اسید آمینه آلانین به والین (C>T) در موقعیت 16 ژن SOD و C-262T در ژن کاتالاز بود.بررسیهای انجام شده نشان داد که SNPهای مورد مطالعه در ژن GPX1 و ژن کاتالاز با پیشرفت بیماری مزمن کلیوی ارتباطی ندارد اما در بیماران CKD که در ژن SOD دارای ژنوتیپهای Ala/Val و Val/Valهستند نسبت به افرادی که دارای ژنوتیپ Ala/Ala هستندکاهش بیشتری در عملکرد کلیه شان نشان میدهند.
(Crawford A et al, 2011)
مطالعهای توسط Singh و همکارانش در سال 2009 در شما هندوستان بر روی ارتباط بین دو ژن GSTM1 و GSTP1 و رد حاد پیوند کلیه انجام گرفت که نشان داد چند شکلیهای این دو ژن رابطه شدیدی با DGF و رد حاد پیوند دارد. (Singh R et al, 2009)
مطالعهای در سال 2013 توسط Guo Y و همکارانش بر روی پلی مورفیسم ژن CTLA4 و بروز عفونت پس از پیوند کلیه در دریافت کنندههای چینی انجام شد که در آن هیچ ارتباطی بین SNP های ژن CTLA
(- 1772 T>C, +49 A>G,+6230 G>A) و عفونتهای باکتریایی پس از پیوند یافت نشد.
(Guo Y et al, 2013)
مطالعهای در سال 2008 توسط Pagliuso و همکارانش بر روی چند شکلیهای ژنهای GSTM1 و GSTT1 با پیشرفت بیماریهای مزمن کلیوی در برزیل انجام شد که نشان داد ژنوتیپهای null این دو ژن هیچ گونه ارتباطی با پیشرفت این بیماری ندارد. (Pagliuso RG et al, 2008)
فصل سوم

مواد و روش ها
1.3- نمونه گیری
در این طرح، مطالعه بر روی 222 نفر از بیماران پیوند کلیه در مرکز پیوند بیمارستان نمازی شیراز طی سالهای 91_1390 انجام شد که از این تعداد 144 نمونه خون کامل و 78 نمونه بافیکت بود. DNA را از نمونههای خون به روش جوشاندن و از نمونههای بافیکت با استفاده از کیت DNP متعلق به شرکت سیناژن استخراج کردیم. نمونههای کنترل نیز به تعداد 224 نمونه در این مطالعه وارد گردید. در نهایت یک مطالعه مورد-شاهدی بین افراد سالم و بیماران پیوند کلیه و یک مطالعه کوهورت بین بیماران پیوند دارای رد حاد و فاقد رد حاد انجام شد. جدول 1.3 مشخصات این بیماران را نشان میدهد. در این مطالعه رد حاد پیوند به افرادی اطلاق میگردد که در طول 6 ماه اول پیوند با بیوپسی (نمونه برداری از بافت) رد حاد آن ها تایید شدهاست.
جدول 1.3:
مشخصات سالم بیماران پیوند کلیه
تعداد کل
میانگین سن 224
14/15±49/40 222
54/14±68/41
2.3- وسایل مورد نیاز
وسایل استفاده شده در این پروژه شامل:
سمپلر(Brand, Socorex)، ترازو، میکرو سانتریفیوژ (Hettich)، ورتکس (Scientific industries INC)، اتوکلاو (ریحان طب)، مایکروفر (بوتان)، دستگاه ترموسایکلر (Techne)، Hot plate(Techne)،Rotator (پدیده نوژن پارس)، PH-meter(Metrohm)، Electrophoresis(تانک الکتروفورز و منبع تغذیه جریان الکتریکی پایامنبع علمی مقاله)، دستگاه Gel documentation(UvitecCambridge).
3.3- محلولهای استفاده شده جهت استخراج DNA از نمونه خون کامل
محلولهای استفاده شده شامل:
NaOH (50 میلی مولار)، TrisHCl (1 مولار)، محلول NH4Cl (170 میلی مولار)، محلول NaCl-EDTA (10 میلی مولار) می باشد که از طریق روش گفته شده در کتاب Molecular Cloning: A Laboratory Manual تهیه شدند. (Green MR et al, 2012)
4.3- محلولهای استفاده شده جهت استخراج DNA از نمونه بافی کت
پروتئاز mg/ml 20 (proteinase K)، Lysis Solution، Wash Buffer (Ethanol Base)
Precipitation Solution(Isoprppanole Base)،Solvent Buffer
5.3- مواد لازم جهت انجام PCR
Taq DNA Polymerase (سیناژن)، dNTPs (سیناژن)، MgCl2 (سیناژن)، بافر 10x(10x buffer) مخصوص PCR(سیناژن) و پرایمر های رفت و برگشت ژن CAT و NQO1 (سیناژن)
6.3- مواد لازم جهت انجام الکتروفورز
بافرTBE، محلول اتیدیوم بروماید (x1000)، Tris Base (سیناژن)، Boric acid (Merck)، EDTA (Merck) 6xloading buffer (سیناژن)، Agarose(Invitrogen)، 100bp DNA ladder (Vivantis)
7.3- مواد استفاده شده جهت اثر دادن آنزیم محدود کننده
آنزیم محدود کنندهhinf1 و EcoRV(Fermentas) و بافرEcoRV و بافرv3
8.3-استخراج DNA از خون محیطی
استخراج DNA از خون کامل به روش جوشاندن (Boiling) انجام شد که جزئیات روش کار طبق موارد گفته شده در منبع مورد نظر میباشد. (Newton CR et al, 1995)
9.3- استخراج DNA از بافی کت با کیت DNP
1- 5 ماکرولیتر Protease را روی 100 ماکرولیتر از نمونه بافی کت ریخته و آن را به مدت 10 ثانیه ورتکس میکنیم سپس تیوب ها را به مدت 10 دقیقه درون Hot plate 72 درجه سانتیگراد قرار میدهیم.
2- بعد از بیرون آوردن تیوب ها از Hot plate 72 درجه، 400 ماکرو لیتر Lysis Solution ریخته و به مدت 20- 15 ثانیه ورتکس میکنیم تا یک سوسپانسیون کاملا هموژن بدست آید بطوری که هیچ لخته یا ماده حل نشدنی درون تیوبها مشاهده نشود.
3- به محلول فوق 300 ماکرولیتر از Precepitation Solution اضافه کرده و برای 5 ثانیه ورتکس میکنیم، سپس تیوبها درون سانترفیوژ با دور g 12000به مدت 10 دقیقه قرار میدهیم.
4- بعد از بیرون آوردن از سانترفیوژ محلول رویی تیوب ها را خالی کرده و تیوب ها را روی یک دستمال به مدت 3-2 ثانیه قرار میدهیم.
5- تیوب ها را برگردانده و به هر کدام 1 میلی لیتر از Wash Buffer اضافه کرده و به مدت 5-3 ثانیه ورتکس کرده و مجددأ درون سانترفیوژ با دورg 12000 این دفعه به مدت 5 دقیقه قرار میدهیم.
6- بعد از اتمام زمان سانترفیوژ مایع رویی را خالی کرده و رسوب ته تیوب را نگه داشته و برای اینکه -Wash Buffer درون تیوبها کاملا خشک شود آن ها را به مدت 5 دقیقه درون Hot plate 65 درجه قرار میدهیم.
7- بعد از خشک شدن تیوبها آن ها را بیرون آورده و 30 ماکرولیتر از 8ه اضافه کرده تیوبها را به آرامی تکان میدهیم و مجددأ درون Hot plate 65 درجه قرار میدهیم به مدت 5 دقیقه تا رسوب ته تیوب که همان DNA است به خوبی حل شود. DNA بدست آمده را در دمای 20- درجه سانتیگراد نگهداری می-کنیم.10.3-PCR
از واکنش زنجیرهای پلیمراز جهت تعیین ژنوتیپهای چندشکلی ژنتیکی ژنهایCAT C-262T و NQO1 C609T استفاده کردیم. برای انجام این کار مواد مورد نیازی که در بالا ذکر شد را از فریزر 20- درجه سانتیگراد بیرون میآوریم. لازم به ذکر است که آنزیم Tag پلیمراز را در آخر، هنگام اضافه کردن بیرون میآوریم. بعد از آب شدن مواد در دمای اتاق جهت درست کردن میکس آنزیم آنها را روی یخ قرار می-دهیم. کلیه مواد به جزdNTP قبل از استفاده به مدت 5 ثانیه ورتکس میکنیم. جهت تهیه 20 ماکرولیتر مخلوط واکنش به ازای هرتیوب، مواد مورد نیاز را طبق جدول 2.3 با هم مخلوط میکنیم.
جدول 2.3- مواد مورد نیاز جهت تهیه مخلوط واکنش PCR
اجزای واکنش حجم مورد نیاز به ازای هر واکنش (μl)
10x PCR buffer 5/2
dNTP (10 mM) 5/0
MgCl2 (50 mM) 75/0
10) پرایمر رفتμM( 1
10)پرایمر برگشتμM( 1
Taq DNA polymerase 3/0
آب استریل 95/13
DNA --plate 5
پرایمرهای رفت و برگشت مورد استفاده جهت تکثیر قطعه مورد نظر از ژنNQO1:
Forward primer 5’-TCC TCA GAG TGG CAT TCT GC-3’
Reverseprimer 5- TCT CCT CAT CCT GTA CCT CT-3’
(Sameer AS et al, 2010)
پرایمرهای رفت و برگشت مورد استفاده جهت تکثیر قطعه مورد نظر از ژن CAT :
Forward primer 5’-CTGATAACCGGGAGCCCCGCCCTGGGTTCGGATA-3’
Reverse primer 5’-CTAGGCAGGCCAAGATTGGAAGCCCAATGG-3’
(Zarbock R et al. 2007)
بعد از اینکه مخلوط واکنش را آماده کردیم در هر تیوب 20 ماکرولیتر از مخلوط ریخته و به آن 5 ماکرولیتر DNA --plate اضافه میکنیم. برای انتقال قطرات چسبیده به دیواره به ته تیوب، به مدت چند ثانیه -spin down میکنیم و در دستگاه PCR قرار میدهیم. جهت انجامPCR از مراحل آورده شده در جداول 3.3 و 5.3 استفاده میکنیم.
جدول 3.3- برنامه تنظیم شده برای واکنش PCRجهت تکثیر ژن NQO1
مرحله دما(°C) زمان
دناتوراسیون اولیه 94 7 دقیقه
41سیکل دناتوراسیون 94 30 ثانیه
اتصال 58 30 ثانیه
طویل شدن 72 30 ثانیه
بسط نهایی 72 5 دقیقه
در ژن NQO1 محصول PCR یک قطعه 230 جفت بازی است. پس از پایان PCR، به 10 ماکرولیتر از محصول PCR، 2 ماکرولیتر از بافرV3و 25/0 ماکرولیتر (معادل 5 واحد) از آنزیم hinfIاضافه کرده و تیوب ها را به مدت 17 ساعت درون Hot plate37 درجه سانتیگراد قرار میدهیم. پس از گذشت مدت زمان لازم، نمونهها را از Hot plate خارج کرده، به منظور جمع آوری قطرات Spin down میکنیم و جهت تفکیک قطعات DNA حاصل از هضم آنزیمی، آن را به دستگاه الکتروفورز منتقل میکنیم.
پس از هضم آنزیمی توسط آنزیم HinfI قطعات bp 200 برای ژنوتیپ CC و قطعات bp151 و bp49 نمایانگر ژنوتیپ TT وقطعات bp200، bp151 و bp 49 نشان دهنده ژنوتیپ CT بدست میآید.
جدول 4.3- قطعات حاصل از هضم آنزیمی برای ژنوتیپ های چندشکلی ژنتیکی NQO1
ژنوتیپ قطعات (جفت باز)
CC 200
CT 49، 151، 200
TT 151،49
جدول 5.3- برنامه تنظیم شده برای واکنش PCRجهت تکثیر ژن CAT
مرحله دما (°C) زمان(min)
دناتوراسیون اولیه 95 5
35 سیکل دناتوراسیون 94 1
اتصال 68 1
طویل شدن 72 1
بسط نهایی 72 5
در ژن کاتالاز قطعات DNA حاصل از PCR190 جفت بازی میباشند. پس از پایان PCR، به 10 ماکرولیتر از محصول PCR، 2 ماکرولیتر از بافرEcoRVو 25/0 ماکرولیتر (معادل 5 واحد) از آنزیم EcoRV اضافه کرده و تیوبها را به مدت 16 ساعت در Hot plate37 درجه سانتیگراد قرار میدهیم. پس از پایان این مدت زمان، نمونهها راخارج کرده، Spin down میکنیم و به الکتروفورز منتقل میکنیم. آلل -262T که آلل موتانت این چندشکلی میباشد، جایگاهی برای اتصال و برش توسط آنزیم EcoRV ندارد. بنابراین، باند 190 جفت بازی نشان دهنده آلل موتانت این چند شکلی است. آلل CAT -262C توسط آنزیم EcoRV برش خورده و دو قطعه 157 و 33 جفت بازی بوجود میآید. قطعات حاصل از هضم آنزیمی برای ژنوتیپ های این چند شکلی در جدول6.3 نشان داده شدهاند.
جدول 6.3- قطعات حاصل از هضم آنزیمی برای ژنوتیپ های چندشکلی ژنتیکی CAT
ژنوتیپ قطعات
TT 190
CT 33، 157، 190
CC 157،33
11.3- الکتروفورز
به منظور مشاهده قطعات DNAحاصل ازRFLP، جهت تعیین چندشکلی ژنتیکی CAT C-262TوNQO1 C609T، آنها را به ژل 5/1 % آگاروز منتقل میکنیم. برای تهیه ژل 5/1 %، 72/1 گرم پودر آگاروز را با 115 سی سی TBE 0.5x مخلوط کرده و با قرار دادن شانه درون ژل چاهک درست میکنیم. پس از سرد شدن ژل و خارج کردن شانه مواد حاصل از هضم آنزیمی را با x Loading 6 مخلوط و به چاهک ها منتقل میکنیم در یکی از چاهکها bp DNA Ladder100 به عنوان نشانگر طول قطعات میریزیم و با برقراری جریان الکتریکی قطعات DNA حاصل براساس اندازه خود در طول ژل از قطب منفی به مثبت دستگاه الکتروفورز حرکت کرده و از هم جدا میشوند.
12.3-رنگ آمیزی ژل
به منظور اینکه قطعات DNA روی ژل آگاروز قابل رؤیت شود، ژل را از دستگاه الکتروفورز بیرون آورده و به مدت 10الی 15 دقیقه درون ظرف حاوی اتیدیوم بروماید (µg/ml1) قرار میدهیم، پس از آن ژل را درون دستگاه Gel documentation قرار داده و با روشن کردن نور UV از آن عکس گرفته و مشاهده میکنیم.

شکل 1.3- نتایج حاصل از PCR -RFLPچند شکلی ژنتیکی CAT C-262T
قابل مشاهده بر روی ژل آگاروز

شکل 2.3- نتایج حاصل از PCR -RFLP چند شکلی ژنتیکی C609TNQO1
قابل مشاهده بر روی ژل آگاروز
13.3- تحلیل آماری
نتایج حاصل از مطالعه که برروی بیماران پیوند کلیه و چندشکلی ژنهای CAT وNQO1 انجام گرفت بانرمافزار SPSS، با به کارگیری روش کای اسکور (x2) و آنالیز آماری رگرسیون لوجستیک و آزمون t-test با در نظر گرفتن سطح معنیداری ٠۵/٠P< مورد تجزیه و تحلیل قرار دادیم.
فصل چهارم

نتایج
1.4-مشخصات افراد شرکت کننده در این مطالعه
در این مطالعه 222 نفر از بیماران پیوند کلیه با میانگین سنی 54/14±68/41 مورد بررسی قرار گرفتند. در میان بیماران پیوند کلیه 41 بیمار با میانگین سنی 47/14±93/43 با رد حاد پیوند کلیه و 181 بیمار با میانگین سنی 56/14±17/41 بدون رد حاد پیوند بودهاند. همچنین 224 نفر افراد سالم با میانگین سنی 14/15 ±49/40 به عنوان گروه کنترل مورد استفاده قرار گرفت.
2.4-نتایج حاصل از بررسی ریسک فاکتور های دخیل در رد پیوند کلیه و مشخصات بیماران
آنالیز عوامل خطر مانند جنسیت پذیرنده و دهنده بافت، گروه خونی، سن گیرنده ودهنده بافت بین گروههای
بیمار دارای رد حاد و فاقد رد حاد پیوند تفاوت معنی داری از لحاظ آماری نشان نداد. )05/0<P)
آنالیز عوامل خطر از طریق تست رگرسیون لوجستیک انجام گرفت. در بررسی عامل RH همانطور که در جدول
زیر مشاهده میشود به دلیل اینکه تعداد افراد با RH منفی در گروه بیمار دارای رد حاد برابر صفر بود نتوانستیم
از این روش آماری استفاده کنیم که بجای آن از Pearson chi-squer استفاده شد و نتیجه برابر با 251/0
بدست آمد. در مورد منبع بافت دریافتی نیز به دلیل کم بودن تعداد بیمارانی که از افراد زنده بافت دریافت
کرده بودند (8=N) نتوانستیم آنالیز بر روی آن ها انجام دهیم ولی بیمارانی که از جسد بافت دریافت کرده
بودند را بطور جداگانه مورد بررسی قراردادیم که در ادامه آمده است.
جدول 1.4- بررسی ریسک فاکتورهای دخیل در رد پیوند کلیه و مشخصات بیماران
فاکتور مورد مطالعه فاقد رد پیوند حاد
(n=181)(%) دارای رد پیوند حاد
(n=41)(%) OR CI%95 P-value
جنسیت گیرنده مرد (2/60)109 (1/56)231 1 زن (8/39)72 (9/43)18 84/0 67/1_ 42/0 627/0
جنسیت دهنده مرد (7/65)119 (3/68)28 1 زن (3/34)62 (7/31)13 15/1 37/2 _ 55/0 706/0
گروه خونی O (8/44)81 (3/46)19 1 A (0/26)47 (6/36)15 36/1 92/2_ 63/0 431/0

 برای دانلود فایل کامل به سایت منبع مراجعه کنید  : elmname.com

یا برای دیدن قسمت های دیگر این موضوع در سایت ما کلمه کلیدی را وارد کنید :

 

AB (7/7)14 (3/7)3 91/0 50/3_ 23/0 895/0
B (5/21)39 (8/9) 4 44/0 41/1_ 14/0 170/0
منبع بافتی جسد (6/95)173 (0/100)41 زنده (4/4) 8 (00/00)0 RH مثبت (1/90)163 (0/100)41
منفی (9/9)18 (00/00)0 جدول 2.4- بررسی ریسک فاکتورهای کمی دخیل در رد پیوند کلیه و مشخصات بیماران
فاکتور مورد مطالعه فاقد رد پیوند حاد دارای رد پیوند حاد df t-test P-value
میانگین سن پذیرنده بافت
میانگین سن دهنده بافت 56/14±17/41
29/16±10/35 47/14±93/43
46/16±17/38 220
220 096/1-
086/1- 274/٠
279/0
3.4- نتایج حاصل از بررسی چند شکلی ژن CATدرافراد سالم و بیماران پیوند کلیه
فراوانی ژنوتیپهای سه گانهCC، CT و TT ژنCAT در گروه سالم به ترتیب:4/63 %، 9/29 % و 7/6 % و در بیماران پیوند کلیه به ترتیب: 0/55 %، 2/39 % و 9/5 %بدست آمد. فراوانی آللهای C و T در افراد سالم به ترتیب: 78/0 و 21/0 و در بیماران پیوند کلیه: 74/0 و 25/0 است. (جدول 3.4) در جمعیت سالم تعادل هاردی- واینبرگ را مورد بررسی قرار دادیم که نشان دهنده نرمال و در تعادل بودن جمعیت بود. (P>0.05، df=1، X2=3.45)
جدول 3.4- مقایسه ژنوتیپ های ژن CAT در گروه سالم و بیمار پیوند کلیه
سالم N(%) پیوند کلیه N(%)
ژنوتیپ ها CC (4/63)142 (0/55)122
CT (9/29)67 (2/39)87
TT (7/6)15 (9/5) 13
آلل C 78/0 74/0
T 21/0 25/0
4.4- نتایج حاصل از بررسی چند شکلی ژن NQO1درافراد سالم و بیماران پیوند کلیه
مطابق با جدول 4.4 فراوانی آلل های C و T ژن NQO1 در افراد سالم به ترتیب: 74/0 و 25/0 و در گروه بیمار به ترتیب: 72/0 و 27/0 بدست آمد. فراوانی ژنوتیپهای CC، CT وTT در افراد سالم به ترتیب: 2/56%، 6/36 % و 1/7 % و در گروه بیمار پیوند کلیه به ترتیب: 5/54 %، 1/35 % و 4/10 % بود و در بررسی گروه سالم مشاهده شد که جمعیت از تعادل هاردی- واینبرگ تبعیت میکند. X2=0.37, df=1, p>0.05))
جدول 4.4- مقایسه ژنوتیپ های ژن NQO1 در گروه سالم و بیمار پیوند کلیه
سالم N(%) پیوند کلیه N(%)
ژنوتیپ ها CC (2/56)126 (5/54)121
CT (6/36)82 (1/35)78
TT (1/7) 16 (4/10)23
آلل C 74/0 72/0
T 25/0 27/0
5.4-مقایسه ی فراوانی ژنوتیپی و آللی بین دو گروه سالم و بیمار
با استفاده از آنالیز آماری رگرسیون لوجستیک مقایسه فراوانیهای ژنوتیپی و آللی ژنهای CAT و NQO1 بین دو گروه سالم و بیماران پیوند کلیه مطابق با جداول 5.4 و 6.4 انجام شد.
جدول 5.4- آنالیز توزیع فراوانی های ژنوتیپی و آللی ژنCAT در بین گروه سالم و بیماران پیوند کلیه
سالم
N بیماران پیوندیN OR CI95% P-value
ژنوتیپ CC 142 122 1 - -
CT 67 87 51/1 25/2_01/1 043/0
TT 15 13 00/1 20/2_46/0 983/0
CT+TTvsCC 82 100 41/1 07/2_97/0 070/0
آلل 351 331 1 - -
C 97 113 23/1 68/1_90/0 182/0
جدول 6.4- آنالیز توزیع فراوانی های ژنوتیپی و آللی ژنNQO1 در بین گروه سالم و بیماران پیوند کلیه
سالم
N بیماران پیوندیN OR CI95% P-value
ژنوتیپ CC 126 121 1 - -
CT 82 78 99/0 47/1_66/0 963/0
TT 16 23 49/1 97/2_75/0 248/0
CT+TTvsCC 98 101 06/1 54/1_73/0 742/0
آلل 334 320 1 - -
C 114 124 13/1 52/1_ 84/0 402/0
با توجه به نتایج بدست آمده در جداول فوق، ارتباط معنیداری بین فراوانی آللها و ژنوتیپهای ژن NQO1 در جمعیت سالم و بیماران پیوندی مشاهده نشد. این مشاهده حاکی از آن است که ژن NQO1 دربروز بیماری کلیوی منجر به پیوند نقشی ندارد. در ژن CAT تنها در ژنوتیپ CT این ژن با 043/0P= ارتباط دیده شد که نشان دهندهی این امر است که ژنوتیپ CT ژن کاتالاز خطر ابتلا به بیماریهای کلیوی منجر به پیوند را به میزان 51/1 برابر افزایش میدهد. (51/1=OR، 25/2-01/1=95% CI، 043/0=P)
6.4-مقایسه ی فراوانی ژنوتیپی و آللی بین بیماران با رد حاد پیوند و بیماران فاقد رد حاد پیوند
مقایسه فراوانیهای ژنوتیپی و آللی بین دو گروه بیماران با رد حاد و فاقد رد حاد پیوند در ژنهای CAT و NQO1 انجام شد. (جداول 7.4 و 8.4) که در ژن CAT هیچ ارتباط معنیداری مشاهده نشد. (05/0<P) درصورتی که در ژن NQO1 در آلل T آن با 05/0=P ارتباط معنیدار دیده شد که نشان دهندهی این است که افزایش فراوانی آلل T در جمعیت خطر بروز رد حاد پیوند در بیماران پیوند کلیه را به میزان 64/1 برابر افزایش میدهد. 64/1=OR، 73/2-99/0=95%CI، 05/0=P) در آلل دیگر و سایر ژنوتیپ های این ژن ارتباط معنی-داری دیده نشد. (05/0<P)
جدول 7.4- آنالیز توزیع فراوانی های ژنوتیپی و آللی در ژن CAT در بین بیماران پیوند کلیه
سالم
N بیماران پیوندیN OR CI95% P-value
ژنوتیپ CC (4/56)102 (8/48)20 1 - -
CT (5/37)67 (8/48)20 52/1 04/3_67/0 234/0
TT (6/6)12 ( 4/2) 1 42/0 45/3_05/0 424/0
CT+TTvsCC 79 21 35/1 67/2_68/0 380/0
آلل (8/74)271 (1/73)60 1 - -
C (1/25)91 (8/26)22 09/1 88/1_63/0 751/0
جدول 8.4- آنالیز توزیع فراوانی های ژنوتیپی و آللی در ژن NQO1 در بین بیماران پیوند کلیه
سالم
N بیماران پیوندیN OR CI95% P-value
ژنوتیپ CC (5/57)104 (5/41)17 1 - -
CT (1/33)60 (9/43)18 83/1 82/3_88/0 105/0
TT (4/9)17 (6/14)6 15/2 24/6_74/0 156/0
CT+TTvsCC 77 24 90/1 79/3_95/0 066/0
آلل (0/74)268 (4/63)52 1 - -
C (9/25)94 (5/36)30 64/1 73/2_99/0 05/0
7.4- بررسی ارتباط ژنوتیپ های ژن CAT وNQO1 با ریسک فاکتورهای رد حاد پیوند کلیه
در بررسی ارتباط ژنوتیپهای ژن CAT وNQO1 با ریسک فاکتور منبع بافت دریافتی در بین بیماران با رد حاد پیوند و فاقد رد حاد، ارتباط معنیداری در بیمارانی که از جسد بافت دریافت کرده بودند مشاهده نشد. (جداول 9.4 و 10.4) در بیمارانی هم که از فرد زنده بافت گرفته بودند به دلیل کم بودن تعداد آن ها امکان آنالیز داده وجود نداشت.
جدول 9.4- اثر ریسک فاکتور منبع بافتی باژنوتیپ های ژنCAT
منبع بافت ژنوتیپ فاقد رد حاد پیوند دارای رد حاد پیوند OR CI 95% P-value
جسد CC (5/55)96 (8/48)20 1 - -
جسد CT (5/37)65 (8/48)20 47/1 96/2_73/0 272/0
جسد T (9/6)12 (4/2)1 40/0 25/3_04/0 392/0
جسد CT+TTvsCC 77 21 30/1 58/2_66/0 439/0
آلل C 257 60 1 - -
T 89 22 05/1 82/1-61/0 837/0
جدول 10.4- اثر ریسک فاکتور منبع بافتی باژنوتیپ های ژنNQO1
منبع بافت ژنوتیپ فاقد رد حاد پیوند دارای رد حاد پیوند OR CI 95% P-value
جسد CC (2/57)99 (5/41)17 1 - -
جسد CT (9/32)57 (9/43)18 83/1 84/3_87/0 106/0
جسد T (8/9)17 (6/14)6 05/2 95/5_71/0 184/0
جسد CT+TTvsCC 74 24 88/ 76/3_94/0 071/0
آلل C 255 52 1 - -
T 91 30 61/1 69/2-97/0 064/0
فصل پنجم

پاسخ دهید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *